富自体CGF纤维蛋白膜对体外培养人牙髓干细胞生物学特性的影响

发布时间：2018-01-08 00:32

本文关键词：富自体CGF纤维蛋白膜对体外培养人牙髓干细胞生物学特性的影响　出处：《河北医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞,其在一定条件下能够向特定的细胞类型分化,有作为种子细胞应用于组织工程,达到修复和重建牙髓组织及形成牙髓-牙本质复合体的潜能。富自体浓缩生长因子(Concentrated Growth Factors,CGF)纤维蛋白被认为是第三代血小板浓缩物,其通过不间断差速离心自体静脉血制备而成。CGF中含有多种生长因子,已有研究证实其对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖及矿化具有促进作用。目的:采用酶消化法体外分离培养、鉴定人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs),分别通过CCK-8法及碱性磷酸酶定量试剂盒检测不同浓度富CGF纤维蛋白膜对HDPSCs增殖及矿化的作用,为HDPSCs及富自体CGF纤维蛋白膜的临床应用提供实验依据。方法:1 HDPSCs的分离、培养及鉴定选取实验志愿者,年龄18-25岁,身体健康,口腔卫生良好,具有拔除阻生齿的指征及需求。志愿者均在河北医科大学第二医院口腔颌面外科行智齿拔除术,拔除的智齿需健康完整,无龋坏,无隐裂,无根尖周组织病变。采用酶消化法对牙髓组织进行原代培养,培养液为含15%胎牛血清的高糖DMEM。待细胞长满80%后,即可对细胞进行传代,首次传代以1:1传代,以后按1:3传代。采用流式细胞仪对HDPSCs进行细胞表面标志物鉴定;绘制细胞生长曲线;通过对细胞成骨及成脂诱导培养,茜素红及油红O染色来鉴定HDPSCs的多向分化能力。2 CGF纤维蛋白膜制备及分组9 ml Medifuge离心机特殊匹配真空采血试管采取志愿者静脉血,将试管立即置入Medifuge离心机,设置CGF程序,差速离心13分钟后即可得到富CGF纤维蛋白凝块,此时可见采血管内血液分为三层,上层为血清,底层为红细胞,中间层即为富CGF纤维蛋白。弃去上层血清,将CGF层与底层红细胞自交界处分离,将CGF多余液体挤出,便可得到富CGF纤维蛋白膜,将纤维蛋白膜剪成3×3mm大小,置于无菌生理盐水中备用。不同浓度的CGF分别加入到不同的实验组中,将加入一片CGF的实验组命名为1CGF组,加入两片CGF的实验组命名为2CGF组,加入三片CGF的实验组命名为3CGF组,另设一不加入CGF的对照组。3 CGF对HDPSCs增殖能力的影响取生长状态良好的第4代HDPSCs,以1×104/孔细胞接种于6孔板内,培养24h后弃去原培养基,实验组分别加入含3个浓度梯度富CGF纤维蛋白膜的10%胎牛血清DMEM培养液,对照组加入不含富CGF纤维蛋白膜的10%胎牛血清DMEM培养液,以上四组分别于培养后1、3、5、7天弃去原培养液,将6孔板内细胞消化接种于96孔板内,加入CCK-8液,细胞培养箱内37℃孵育两小时,检测各组450nm处吸光度值。4 CGF对HDPSCs矿化能力的影响取生长状态良好的第4代HDPSCs,以2×105/孔细胞接种于6孔板内,培养24h后弃去原培养基,实验组分别加入含3个浓度梯度富CGF纤维蛋白膜的矿化诱导液,对照组加入不含CGF纤维蛋白膜的矿化诱导液,以上四组培养7天、14天后,弃去原培养液,根据碱性磷酸酶定量试剂盒说明书测定各组碱性磷酸酶活性。5统计学分析采用SPSS13.0统计软件对实验数据作单因素方差分析,用SNK法和Dunnett’s T3法做两两比较,实验数据为均数±标准差,P0.05差异具有统计学意义。结果:1通过酶消化法进行HDPSCs原代培养,镜下观察细胞形态大体呈梭形,胞体丰满,包浆丰富,核仁圆形或椭圆形,位于细胞中央。流式细胞术检测细胞表面抗原CD44、CD29呈阳性,CD34、CD45呈阴性,细胞成骨成脂诱导四周后,茜素红染色可见细胞内有红色钙化物形成,油红O染色可见细胞内有红色脂滴形成。2与对照组相比,实验组各CGF浓度均对HDPSCs的增殖起促进作用,且该促进作用具有浓度依赖性,随着CGF浓度的增加,其促进作用增强。3与对照组相比,实验组各CGF浓度均对HDPSCs的成牙本质/成骨分化起促进作用,且该促进作用具有浓度依赖性,随着CGF浓度的增加,其促进作用增强。结论:1通过酶消化法培养的HDPSCs,细胞形态学表现,细胞表面抗原及细胞分化能力鉴定结果均符合人牙髓干细胞生物学特性。2一定浓度范围内的CGF对于HDPSCs的增殖及分化可起到促进作用,为CGF及牙髓干细胞的组织工程研究乃至临床应用提供了新的契机。
[Abstract]:Objective : To study the proliferation and mineralization of human dental pulp stem cells ( HDPSCs ) . The experiment group was divided into two groups : 1 脳 10 % fetal bovine serum DMEM culture medium containing 3 concentration gradient rich CGF fibrin membranes . The experimental group was divided into 2 脳 10 % fetal bovine serum DMEM culture medium . The experimental group was divided into 3 脳 10 % fetal bovine serum DMEM culture medium . Compared with the control group , the CGF concentration in the experimental group promoted the proliferation and differentiation of HDPSCs . Conclusion : The CGF in the experimental group can promote the proliferation and differentiation of HDPSCs , and provide a new opportunity for the research of the tissue engineering of CGF and dental pulp stem cells and even clinical application .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R78

【参考文献】