乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响

发布时间：2018-01-15 04:25

本文关键词：乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响　出处：《南方医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景及目的牙周病是成年人中最常见的口腔疾病之一,可造成牙骨质、牙周膜、牙槽骨、牙龈组织的破坏,最终导致牙齿松动、脱落,是危害人类健康的重要原因。恢复牙周支持组织是牙周病治疗的最终目的。正常牙周组织具有自我更新和修复的能力,其修复能力主要是通过人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)的多种功能来实现的。hPDLCs是牙周膜中最主要的细胞成分,具有多向分化潜能,可分泌、收缩胶原,是形成牙周膜、牙骨质、牙槽骨等牙周附着组织的主要来源,是牙周组织再生修复的基础。在牙周炎症发生发展过程中宿主的自身免疫作用已得到充分的研究和肯定,而牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎症的主要致病菌,其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引发hPDLCs自身免疫反应的主要毒力因子,在牙周炎症中起着至关重要的作用。因此调节炎症与促进支持组织重建是牙周病治疗过程中不可忽视的两个要点。乳铁蛋白(lactoferrin,LF)是存在于人体多种组织中的糖蛋白,具有抗菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖等特性,参与构成宿主非特异性免疫系统,也是口腔唾液防御体系中的重要组成部分。近年来研究认为LF对骨的生长代谢也起着重要作用,其能够诱导骨髓间充质干细胞中成骨标记物的表达,抑制感染相关破骨细胞的形成,促进成骨细胞的增殖和分化的特性已得到证实。本课题组在早期的研究中已发现LF可以下调脂多糖激发的hPDLCs Toll样受体4的表达,表明LF在牙周炎的免疫治疗方面有着积极意义。牙周炎治疗的理想药物应具备调节炎症和促进成骨两方面作用,因此本研究旨在探讨LF对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响,以及LF对经LPS刺激的人牙周膜细胞成骨分化的影响,初步探索LF在促进牙周组织修复方面的作用,为临床上新的牙周病治疗方法提供理论依据。第一章人牙周膜细胞的体外培养和鉴定体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells, hPDLCs),观察体外培养的人牙周膜细胞的形态特征及其鉴定。方法1.取15～22岁因正畸需要拔除的健康前磨牙,要求牙体牙周牙髓健康,拔出时无污染。无菌条件下刮取根中三分之一的牙周膜组织,用组织块酶消化法将牙周膜组织进行原代培养并传代。取原代hPDLCs及培养至第3代的hPDLCs,倒置相差显微镜下观察其生长形态及特征。2.免疫组化SP(streptavidin-perosidase)法抗波形丝蛋白、角蛋白染色：选择第3代生长良好的hPDLCs制作细胞爬片,在水浴箱中用3%过氧化氢去离子水37℃孵育20min,山羊血清封闭30min,滴加一抗,37℃湿盒内放置2h,冲洗后滴加二抗,37℃孵育30min,冲洗,DAB显色反应试剂盒作用10min,脱水,封片。倒置显微镜下观察并拍照。3.取第3代hPDLCs,消化成密度为1×106 mL-1的细胞悬液,分别加入小鼠抗人CD29、CD44、CD105、CD90单抗,室温孵育1h；洗涤后加入羊抗鼠Ig-FITC,室温下避光45min;洗涤后弃上清,加PBS重悬,流式细胞仪检测细胞分子表型。4.MTT法检测hPDLCs活性：取第3代生长良好的hPDLCs以5×104mL-1的密度接种于96孔板。分别在第1d、3d、5d、7d检测OD值：在待检测细胞中加入20 μ1 MTT液,孵箱避光孵育4 h；吸弃原培养液,加入150μl二甲基亚砜,振荡15min;分光光度计测定各孔OD值并绘制生长曲线。5.茜素红染色法检测hPDLCs的矿化能力：以5×104mL-1的密度将第3代hPDLCs接种于六孔板,待细胞长至70%-80%时,加入矿化诱导培养基,连续培养14 d,茜素红染色,倒置显微镜下观察并拍照。结果1.组织块酶消化法分离培养hPDLCs成活率较高。观察显示：游出细胞为梭形和星形,体积较大,细胞核居中,为成纤维细胞样细胞。传代后细胞可于24h内贴壁,贴壁后部分hPDLCs伸展为不规则星形或圆形,大部分仍为梭形,呈放射状或漩涡状增殖。2.SP法抗波形丝蛋白、角蛋白染色结果显示,波形丝蛋白染色后细胞质深染,显阳性：角蛋白染色胞质浅染,为阴性。3.流式细胞仪分析hPDLCs分子表型显示：CD29、CD44、CD90、CD105标志的阳性细胞率分别为98.17%、99.13%、100%和78.21%,与结果2共同表明所培养细胞为间充质来源。4. hPDLCs接种第3d细胞增长迅速,进入对数生长期,第5-7d处于平台期,符合成纤维细胞生长规律。5.矿化诱导14d的hPDLCs,茜素红染色后显微镜下可见若干大小不等的红褐色结节形成。第二章乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖、迁移的影响采用MTT法、划痕实验、Transwell法分别检测乳铁蛋白对hPDLCs增殖、迁移(水平迁移和垂直迁移)的影响,探讨乳铁蛋白是否能够促进hPDLCs的增殖和迁移。方法1.人牙周膜细胞的培养同第一章。2.将第3代HPDLCs按5×104 mL-1的密度接种至96孔板,同时将培养基更换为含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL LF的完全培养基,按培养及成分不同分组,每组6个复孔,分别在接种后的第1d、3d、5d、7d进行MTT检测,检测时每孔加入MTT溶液20μL,孵育4h后吸出孔内液体,每孔加入150μL二甲基亚砜,微震荡10min,分光光度计检测490nm波长处的OD值,绘制生长曲线。3.取第3代生长良好的hPDLCs,以5×104 mL-1接种于6孔板,待细胞长至80%-90%后,用200μL规格枪头沿尺子在6孔板底部划出1mm宽划痕,并标记观测点。PBS溶液冲洗掉脱落细胞后,更换含有0μg/mL、10μg/mL、 20μg/mL LF的无血清培养基,每组3个复孔,在加入刺激后选择Oh、24h、48h对观测点拍照。4.取第3代生长良好的hPDLCs,以5×104 mL-1密度接种至Transwell上室,用不含血清的培养基将体积调至200μL,下室分别加入含0μg/mL、10μg/mL、 LF的完全培养基500μL,每组3个复孔,孵育24h后弃去小室液体,用棉签擦去上室未迁移细胞,4%多聚甲醛固定10min,1%结晶紫染色15min,PBS溶液冲洗,200倍视野下随机选取5处,读取细胞个数并计算均值。5.统计学分析：所得数据用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,设定检验水准α=0.05；对方差齐性(Levene方差齐性检验)的资料采用Bonferroni法,若方差不齐采用Dunnett's T3法进行多重比较。结果1.MTT法结果显示三组细胞生长曲线均呈“S”形,且在第3d进入对数生长期,第5d进入平台期,其中10μg/mL和10μg/mL组在各时间点增殖能力均高于0μg/mL LF组,差异具有显著性(P0.05)。2.经过24 h培养,各组细胞均向空白划痕处迁移,但0μ/mL LF组迁移速度较慢,迁移48h后,10μg/mL、20μg/mL LF组几乎可将原有划痕覆盖,而0μg/mLLF组仍能观察到清晰的划痕。3. Transwell法结果显示,24h后10μg/mL、20μg/mL LF组的迁移细胞数量均高于0μg/mL LF组,差异具有显著性(P0.05)。第三章乳铁蛋白对人牙周膜细胞成骨分化的影响通过茜素红染色、PNPP法、qRT-PCR以及Western Blotting analysis观察乳铁蛋白对hPDLCs矿化结节形成以及对成骨诱导相关基因和蛋白表达的影响,探讨乳铁蛋白是否具有促进hPDLCs成骨分化的作用。方法1.人牙周膜细胞的培养同第一章。2.将第3代hPDLCs按5×104mL-1的密度接种于6孔板,待细胞单层贴壁后更换完全培养基为含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳铁蛋白的成骨诱导液,每组3个复孔,每3d换液1次,矿化14d后弃去培养液,4%多聚甲醛固定10 min,1%茜素红染色30分钟,拍照并计算矿化结节面积。3.取第3代生长良好的hPDLCs,按照5×104mL-1接种于6孔板中,待细胞单层贴壁后更换为含有0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL乳铁蛋白的成骨诱导培养基培养14d后使用细胞裂解液裂解细胞,提取蛋白,使用96孔板按照PNPP试剂盒说明书进行操作,检测碱性磷酸酶活性。碱性磷酸酶活性(U/gprot)=(测定孔吸光度—空白孔吸光度)/(标准孔吸光度—空白孔吸光度)×酚标准品浓度(0.1 mg/mL)/待测样本蛋白浓度(gprot/mL)。4.取第3代生长良好的hPDLCs,以5×104mL-1接种于6孔板中,完全培养基培养24 h至贴壁,分为0μg/mL乳铁蛋白组、10μg/mL乳铁蛋白组、20μg/mL乳铁蛋白组加入不同浓度乳铁蛋白,并将培养基换为矿化诱导培养基。矿化诱导14 d后用Trizol提取各组总RNA,-80℃冻存备用。以总RNA为模板分别逆转录为cDNA,按照说明书配制PCR反应液,经过预变性、PCR反应、融解曲线分析完成扩增,检测各组碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)的基因表达。5.取第3代生长良好的hPDLCs,以5×104mL-1接种于6孔板中,完全培养基培养24 h至贴壁,分别加入0μg/mL、10μg/mL、20μ/mL乳铁蛋白以及矿化诱导培养基,14 d后收集各组细胞,提取各组细胞的总蛋白,然后进行WesternBlotting analysis来检测各组OPN和OCN的蛋白表达情况。6.统计学分析：所得数据用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,检验水准α=0.05;对方差齐性(Levene方差齐性检验)的资料采用Bonferroni法,若方差不齐采用Dunnett's T3法进行多重比较。结果1.茜素红染色结果显示各组均有矿化结节形成,但0 μg/mL LF组矿化结节面积明显较另两组少,差异具有显著性(P0.05)。且20 μg/mL LF组矿化结节面积较10 μg/mL LF组大,差异具有显著性(P0.05)。2. PNPP法检测碱性磷酸酶活性结果显示10 μg/mL LF组与20 μg/mL LF组碱性磷酸酶活性均高于0 μg/mL LF组,且差异具有显著性(P0.05)。3.成骨相关基因的表达：实时荧光定量PCR结果显示,在LF刺激下成骨相关基因ALP、OCN、OPN的表达均增高,且10μg/mL、20μg/mL LF组与0μg/mLLF组相比有统计学差异(P0.05)。4. Western Blot结果显示：10μg/mL LF组与LF组OPN的蛋白条带灰度值明显高于0μg/mL LF组,将各组灰度值进行统计学分析,10μg/mLLF组,20μg/mL LF组与0μg/mL LF组之间的差异具有显著性(P0.05)。第四章乳铁蛋白对LPS刺激下人牙周膜细胞成骨分化的影响检测在LPS刺激下hPDLCs炎症因子分泌情况以及在炎症环境下LF对hPDLCs成骨分化的影响,从而探讨LF在炎症环境下对hPDLCs是否具有促进成骨的作用。方法1.人牙周膜细胞的培养同第一章。2.取第3代生长良好的hPDLCs,以5×104mL-1接种于6孔板中,当细胞生长至80%-90%时,将细胞分为空白对照组,0.01μg/mL LPS组,0.1μ/mL LPS组,1μg/mL LPS组。按分组加入不同刺激物,培养24 h后提取各组总RNA,进行荧光实时定量PCR,检测各组细胞TLR4,IL-6,IL-8的基因表达。3.取第3代处于对数生长期的hPDLCs,以5×104mL-1接种于6孔板中,当细胞生长至80%-90%融合时,更换为矿化诱导培养基,按照之前实验选择合适的LPS及LF刺激浓度,将细胞分为矿化液组,LPS+矿化液组,LPS+LF+矿化液组。矿化诱导培养7d后进行茜素红染色,倒置显微镜下观察矿化结节形成情况并拍照,计算矿化结节面积并计算平均值。4.选取第3代生长良好并处于对数生长期的hPDLCs,用0.25%胰蛋白酶消化,重悬细胞,以5×104mL-1的密度接种于6孔板,放入恒温培养箱培养,待细胞单层贴壁后将细胞更换为矿化诱导培养基,分组同上。7 d后弃去培养液,裂解细胞,按照ALP试剂盒说明书进行操作,检测碱性磷酸酶活性。5.选取第3代生长良好并处于对数生长期的hPDLCs,用0.25%胰蛋白酶消化,重悬细胞,以5×104mL-1的密度接种于6孔板,放入恒温培养箱培养,待细胞单层贴壁后将细胞更换为矿化诱导培养基,分组同上。7 d后弃去培养液,收集各组细胞,提取总蛋白,然后进行Western Blotting analysis检测各组细胞OCN和OPN的蛋白表达情况。6.统计学分析：所得数据用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析,检验水准α=0.05;对方差齐性(Levene方差齐性检验)的资料采用Bonferroni法,若方差不齐采用Dunnett's T3法进行多重比较。结果1. 0.01μg/mL LPS组TLR4表达量与对照组无差异(P0.05),而IL-6、IL-8的表达与对照组的差异具有显著性(P0.05);0.1μg/mL LPS组与1μg/mL LPS组TLR4、IL-6、IL-8的表达量与对照组之间的差异均具有显著性(P0.05)：0.1μ/mL LPS组TLR4及IL-8的相对表达量与1μg/mL LPS组相比差异具有显著性(P0.05)。2.三组细胞均可观察到矿化结节的形成,其中LPS+LF+矿化液组矿化结节面积较大,与LPS组相比差异具有显著性(P0.05),LPS+矿化液组矿化结节面积较矿化液组少,与矿化液组间差异具有显著性(P0.05)；但矿化液组与LPS+LF+矿化液组之间的差异没有显著性(P0.05)。3.LPS+矿化液组ALP活性表达量最低,LPS+LF+矿化液组ALP活性表达量最高,且与LPS组相比差异具有显著性(P0.05)。矿化液组与LPS+矿化液组间差异不具有显著性(P0.05)。4. Western Blot结果显示,LPS+矿化液组OCN、OPN的蛋白表达量较OM组略有下降,但差异不具有统计学意义(P0.05);LPS+LF+矿化液组OCN、 OPN蛋白表达量较矿化液组、LPS+矿化液组增高,且差异具有显著性(P0.05)。结论1.通过组织块酶消化法分离培养的细胞在游出时间、成活率、感染率等方面均具有优势,细胞在传至第7代时仍具有增殖、矿化等能力; 利用流式细胞仪分析细胞表面分子表型、免疫组化染色,并结合获取组织部位证明了所培养的细胞为hPDLCs,来源可靠,并且具有增殖、分化的能力。2.在LF的作用下,hPDLCs增殖能力较不添加LF时提高较为明显,LF对水平迁移和垂直迁移能力均有增强作用,但hPDLCs的增殖和迁移并未表现出随浓度的增加而提高的趋势。3.在矿化诱导正常状态hPDLCs过程中,LF可以促进矿化结节的形成,提高成骨相关基因以及成骨相关蛋白的表达,表明LF具有促进hPDLCs成骨分化的作用。其中成骨相关蛋白的表达量随着LF浓度的改变而产生差异,说明LF的浓度对hPDLCs成骨分化有一定影响。4.LPS刺激后的hPDLCs炎症因子分泌增加,更加符合牙周炎发生发展过程中hPDLCs所处环境,在LPS刺激下发现通过LF的调节,hPDLCs成骨分化能力较仅有LPS刺激时有所提高。进一步为LF作为临床治疗牙周炎药物提供理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R781.4

【相似文献】