牙髓干细胞在鼠尾胶原和钛金属表面生物学特性比较研究

发布时间：2018-01-18 10:39

  本文关键词：牙髓干细胞在鼠尾胶原和钛金属表面生物学特性比较研究　出处：《吉林大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究目的:目前DPSCs生物学特征的研究多为干细胞的定向分化研究。因此,本实验主要研究目的为DPSCs在鼠尾胶原蛋白和钛金属上的细胞表型特点、细胞活性、矿化潜能、组织再生能力、多向分化潜能的体外生物学特性比较。实验方法:完整拔除牙根尚未发育完全的正畸牙或从未有牙体牙周疾病的第三磨牙(16-28岁),用组织块发原代培养DPSCs,之后分组。分三组,空白对照组,正常培养(10%FBS+α-MEM培养液);实验组A:加入鼠尾胶原蛋白和10%FBS+α-MEM培养液;实验组B:加入钛金属和10%FBS+α-MEM培养液。倒置显微镜下观察三组DPSCs原代细胞和传代细胞的生长和传代特征。之后将三组P2细胞接种于盖玻片上,用荧光免疫技术检测DPSCs表明标记物STRO-1的表达情况。再将对数生长的三组细胞制成细胞悬液,接种至6孔板中,培养7D后,加入结晶紫染液染色,观察细胞克隆形成情况。采用MTT法分别连续10D测定三组DPSCs的P3细胞的OD值,绘制三组DPSCs的生长曲线。在取三组P2细胞在成脂诱导液下进行培养,观察到脂滴形成后使用油红-O染色。对经矿化诱导4W后的三组细胞进行西红素染色,并行半定量测定两组干细胞的钙含量以比较鼠尾胶原蛋白和钛金属对DPSCs矿化结节形成能力的影响。对矿化诱导4W后的三组DPSCs采用免疫荧光技术检测成骨标志碱性磷酸盐(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎磷蛋白(bone sialophosphoprotein,BSP)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)、骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。应用荧光定量PCR仪7900分别检测三组DPSCs矿化诱导3D,14D,21D的ALP、BSP、DSP、OC基因的m RNA表达水平,定量比较鼠尾胶原蛋白和钛金属对干细胞体外成骨/成牙骨质能力的影响。结果:连续培养7D后,倒置显微镜下三组均可见有贴壁细胞以组织块为中心成放射状生长。三组中的大部分细胞为成纤维细胞样生长,呈梭状,轮廓清晰,大小基本一致。对P0的三组DPSCs爬片进行抗STRO-1免疫荧光检测,镜下三组DPSCs细胞核均呈蓝色荧光,胞浆呈绿色荧光,是阳性表达。培养7D后进行结晶紫染液染色,镜下均可见有明显的细胞集形成,其中A组克隆形成率为8.5%,B组为5%。经统计学分析,A组形成率高于B组,差异具有统计学意义(p0.05)。DPSCs的生长曲线呈“S”型,1-2D是潜伏期,3-8D为对数生长期,细胞加速生长,8D后进入平台期,细胞生长速度减缓,符合干细胞慢周期的特点,P4开始A组和B组相比较,差异存在统计学意义(p0.05)。三组DPSCs体外诱导成脂3W后进行油红-O染色均呈阳性,倒置显微镜下观察到有明显的红色脂滴形成。矿化诱导4W后,三组细胞使用茜素红染色法检测,可见有橘红色矿化结节形成。茜素红半定量检测三组细胞的钙含量,其中A组的钙含量为5.89±0.41,明显高于B组的3.83±0.27,差异具有统计学意义(p0.05)。对矿化诱导4W后的DPSCs进行抗ALP、BSP、DSP、OC的免疫荧光检测,结果为阳性,其中A组荧光强度明显高于其他2组。荧光定量PCR结果显示随着诱导时间的增加,BSP、DSP和OC基因水平表达上升,而ALP基因水平表达则随诱导时间的增加而下降,且A组中的各基因的m RNA表达水平均高于其他2组,差异具有统计学意义(p0.05)。结论:本实验成功地对人恒牙牙髓干细胞进行原代培养,并且在体外分别对鼠尾胶原蛋白和钛金属对恒牙牙髓干细胞的成骨性/牙源性的分化及相关成骨标志物的鉴定和比较,并证实了鼠尾胶原蛋白对DPSCs关于以上综述各指标的影响和促进作用。
[Abstract]:In this study , three groups of DPSCs were cultured under an inverted microscope . The results showed that the expression of ALP , BSP , DSP and OC increased with the increase of induction time . The results showed that the expression of ALP , BSP , DSP and OC increased with the increase of induction time .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R783.1

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本文编号：1440616