纤维内硅化胶原促人牙髓干细胞成骨分化的研究

发布时间：2018-02-01 16:54

本文关键词： 胶原支架人牙髓干细胞纤维内硅化成骨分化骨再生　出处：《第四军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肿瘤、骨质疏松、创伤、骨关节炎等多种原因导致的骨缺损一直严重影响着人们的健康和生活质量。尽管自体骨移植被认为是骨缺损的最佳修复方法，但是仍存在供体有限、手术创伤、并发症较多、手术时间长等问题。而同种异体骨移植和异种骨移植，则由于免疫排斥、生物相容性较差等缺点，在临床应用中受到了很大的限制。因此寻找理想的骨替代材料，成为了骨缺损修复面临的重要难题。随着研究的不断进展，近年来基于干细胞的骨组织工程已在骨缺损修复材料的研制方面取得一系列重要的进展。为了实现功能化骨的再生，组织工程三大关键要素即种子细胞、支架材料和生物活性因子的选择和整合至关重要。虽然骨髓间充质干细胞具有良好的成骨分化潜能，并已经在骨组织的重建再生方面得到了广泛的研究，然而细胞获取困难、费用高昂、创伤较大等问题限制了其在临床中的应用。与骨髓间充质干细胞相比，牙髓干细胞的获取方法容易，获取过程对患者造成的创伤和经济负担小，具有更高的克隆形成能力，并且已有研究表明牙髓干细胞能够分化为成骨细胞并形成骨组织，因此牙髓干细胞有望替代骨髓间充质干细胞，成为骨组织工程中理想的自体种子细胞。除种子细胞以外，支架材料是骨组织工程的又一重要因素，常见的支架材料有金属、陶瓷、天然聚合物和合成聚合物等，然而现有的材料仍无法满足理想组织工程支架材料的要求。I型胶原为骨细胞外基质的主要有机成分，具有良好的生物相容性，是骨组织工程中常用的支架材料，但是易降解和机械性能较差等问题成为其应用的掣肘。为了解决这一问题，本课题组在前期研究中在国际上首次实现了重组I型胶原支架的纤维内硅化，显著提高了胶原支架的机械性能和耐酶解性，并且证实该支架材料能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，，显示了其在骨缺损修复领域的应用前景。然而纤维内硅化胶原是否能促进牙髓干细胞的成骨分化，其分化特征如何，目前仍不清楚。因此本研究的目的是探索纤维内硅化胶原对牙髓干细胞成骨分化的影响，从而为纤维内硅化胶原和牙髓干细胞在骨组织工程中的应用提供实验基础。主要实验内容及结果 1.纤维内硅化胶原对人牙髓干细胞活性的影响从人牙髓中分离牙髓干细胞，通过细胞形态、克隆形成能力、干细胞表面标志物等方面对细胞干性进行鉴定；通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）观察细胞生长情况和Propidium iodide检测细胞凋亡坏死情况，评估纤维内硅化胶原对细胞粘附、伸展及细胞凋亡坏死特性的影响；通过细胞周期实验和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）含量测定实验，检测纤维内硅化胶原对人牙髓干细胞增殖特性的影响。结果表明所分离培养的人牙髓干细胞为成纤维样细胞，克隆形成率为25%，间充质干细胞的表面标志物CD29、CD44、CD90和CD105的表达为阳性，造血干细胞的表面标志物CD34和CD45的表达为阴性；纤维内硅化胶原组、未硅化胶原组和空白对照组中正常人牙髓干细胞所占百分比无统计学差异（p＞0.05）；纤维内硅化胶原组中人牙髓干细胞的DNA含量和S期细胞百分比均明显高于未硅化胶原组和空白对照组（p＜0.05）。 2.纤维内硅化胶原促进人牙髓干细胞成骨分化的体外实验研究通过实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、蛋白免疫印迹、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、ALP活性检测、茜素红染色和冯库萨染色，从多个角度评估纤维内硅化胶原对人牙髓干细胞成骨分化的影响。结果表明，与未硅化胶原组和阴性对照组相比，纤维内硅化胶原组中的成骨标志基因和蛋白成骨特异性转录因子（runt-related transcription factor2，RUNX2）、成骨相关转录因子（osterix，OSX）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、ALP和I型胶原（type I collagen，COLI）的表达水平均明显增高（p＜0.05）；纤维内硅化胶原组中人牙髓干细胞内ALP活性及矿化沉淀形成量明显高于未硅化胶原组和阴性对照组（p＜0.05）。 3.纤维内硅化胶原促进人牙髓干细胞成骨分化的体内实验研究分别构建人牙髓干细胞与纤维内硅化胶原及未硅化胶原的复合体，将各组细胞-支架复合体植入裸鼠皮下，8周后，进行伊红和苏木精（hemotoxylin and eosin，HE）染色、茜素红染色、冯库萨染色和免疫组织化学染色，观察骨样组织的形成情况。结果表明，纤维内硅化胶原组中骨细胞、血管和骨样组织的形成均明显多于未硅化胶原组和阴性对照组（p＜0.05）；纤维内硅化胶原组中矿化沉淀形成的量和成骨标志蛋白OCN的表达水平均明显高于未硅化胶原组和阴性对照组（p＜0.05）。综上所述，纤维内硅化胶原支架具有良好的生物相容性，与普通胶原支架相比，能够明显促进人牙髓干细胞的增殖、成骨分化和矿化，该支架材料与人牙髓干细胞复合后能够在动物体内取得良好的成骨效果。纤维内硅化胶原和人牙髓干细胞的联合应用有望为临床骨缺损的修复治疗提供一种新的选择。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783.3

【共引文献】