DDIT3在周期性张应力诱导成肌细胞自噬与凋亡中的作用与机制

发布时间：2018-02-20 02:20

本文关键词： DDIT3 周期性张应力自噬细胞凋亡 ATG5　出处：《青岛大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:功能矫形是口腔颌面部畸形的重要早期矫治方法,主要通过矫形力牵张口腔颌面部肌肉发生适应性改建以发挥治疗效果。本实验通过体外模拟应力刺激方法,结合分子生物学技术,从微观层面探讨周期张应力对成肌细胞的作用与机制。并针对内质网应激相关基因DDIT3展开初步研究,旨在进一步阐明功能矫形治疗的作用机制,为临床治疗提供更完善的理论支持。方法:采用大鼠L6成肌细胞株,体外培养并构建成肌细胞体外-力学刺激模型;细胞分别加载频率为10 cycles/min,拉伸变形率为15%的周期性张应力2、6、12、24小时,并以0h组(不加力)作对照,除应力加载时间外其它条件均保持一致。采用Hochest 33258染色的方法观察各组成肌细胞凋亡的情况;并应用Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测不同应力加载时间对大鼠成肌细胞凋亡率的影响,运用Real Time PCR和Western Blot分别检测内质网应激相关基因DDIT3和凋亡相关基因BBC3的m RNA和蛋白表达变化,检测各组成肌细胞的自噬相关基因LC3、P62、ATG5的蛋白表达量;利用3-MA自噬抑制成功剂抑制成肌细胞自噬后,结合流式细胞术分析自噬抑制后细胞凋亡率的变化;采用si RNA干扰DDIT3的表达,检测干扰前后BBC3和ATG5的m RNA表达变化,并运用Western Blot比较干扰DDIT3后BBC3和ATG5的蛋白变化相较各加力组的差异。以上各项实验数据采用SPSS17.0软件进行统计学分析。结果:1.经Hoches染色和流式细胞术检测大鼠L6成肌细胞凋亡率,结果均表明成肌细胞加载频率为10 cycles/min,拉伸变形率为15%的周期性张应力后可诱发细胞凋亡,且凋亡率与应力加载时长呈相关性,即随应力加载时间延长大鼠成肌细胞凋亡率明显上升,并且在应力加载24h时达到最高。2.RT-PCR结果显示:随应力加载时间延长DDIT3和BBC3的m RNA表达量逐渐上升,并在加力24h时达最高值,Western Blot检测DDIT3和BBC3的蛋白表达结果也呈现与应力加载时间正相关的趋势(p0.05)。3.Western Blot结果提示LC3、ATG5的蛋白表达量与应力加载时间呈正相关,p62的蛋白表达量于2h先升高随后呈下降趋势(p0.05)。4.经3-MA自噬抑制剂处理后的细胞在加力24h后,经流式细胞术检测,其细胞凋亡率明显高于未经自噬抑制剂处理的24h加力组,(p0.05)。5.运用si RNA成功干扰DDIT3后,RT-PCR检测干扰前后BBC3和ATG5的m RNA表达结果显示其表达量较加力24h组均明显下降,(p0.05)。6.Western Blot检测DDIT3干扰后的BBC3和ATG5的蛋白表达结果提示,BBC3和ATG5的蛋白表达水平均低于24h组,但较对照组甚至2小时组的表达量仍明显偏高,(p0.05)。结论:1.拉伸幅度为15%,频率为10 cycles/min的周期性张应力可诱导成肌细胞发生凋亡;2.成肌细胞在周期性张应力加载条件下的凋亡与应力加载的时间呈正关性,即成肌细胞凋亡率随加力时间的增长逐渐升高;3.应力加载条件下内质网应激相关基因DDIT3表达水平升高,表明成肌细胞在周期性张应力诱导下发生了内质网应激;4.周期性张应力可诱导成肌细胞发生自噬,且自噬的强度与应力加载时间呈现相关性,随应力加载时间的延长自噬强度越强;5.抑制应力介导的成肌细胞自噬后,细胞凋亡率明显升高;6.DDIT3可能作为转录因子通过调控BBC3的表达参与应力介导内质网应激诱导的成肌细胞凋亡;通过调控ATG5的表达参与应力介导内质网应激诱导的成肌细胞自噬。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of cyclic tensile stress on the apoptosis rate of myoblasts in rats after stress loading . Results : 1 . The expression level of BBC3 and ATG5 was significantly higher than that in the control group .

【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.5

【参考文献】