抗坏血酸碳点诱导的自噬对口腔黏膜鳞癌KB细胞凋亡的作用研究

发布时间：2018-03-01 18:45

本文关键词： 抗坏血酸碳点口腔黏膜鳞癌自噬凋亡　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:口腔黏膜鳞癌是口腔颌面部发病率最高的恶性肿瘤,严重威胁人类的生命与健康。化学治疗作为口腔鳞癌序列治疗的重要手段之一,能够有效地杀伤肿瘤细胞、防止肿瘤的复发及转移,但其对正常组织器官的毒副作用往往限制了化疗的应用。纳米载体能够有效地运载抗癌药物或基因,减少化疗的毒副作用,因而被广泛应用于肿瘤治疗。碳点是近年来新兴的一种碳纳米材料,除能发挥纳米载体的功能外还具有独特的发光性能,在生物成像、肿瘤化疗等肿瘤诊治领域中具有巨大的应用前景。但目前人们主要聚焦于碳点的荧光特性及纳米载体的应用上,而碳点对肿瘤细胞尤其是对口腔鳞癌细胞的杀伤作用仍研究甚少,若碳点能直接杀伤肿瘤细胞,可能协同其所负载的药物或基因共同发挥抗癌效果。研究表明,纳米材料能够诱导肿瘤细胞发生自噬和凋亡,而自噬又可能对肿瘤细胞的凋亡产生不同的影响。因此,研究碳点对口腔黏膜鳞癌KB细胞的杀伤作用,并探索细胞自噬及凋亡在这个过程中所起的作用,可能为口腔黏膜鳞癌的治疗提供新的视野与策略。目的:探讨抗坏血酸碳点对口腔鳞癌KB细胞增殖、自噬及凋亡的影响,明确抗坏血酸碳点对口腔鳞癌KB细胞的杀伤作用机制,为未来抗坏血酸碳点协同负载的药物或基因应用于口腔黏膜鳞癌的治疗提供理论基础。方法:首先采用微波法制备抗坏血酸碳点,通过透射电子显微镜(TEM)观察碳点的形貌及尺寸,动态光散射分析碳点的水合粒径及电势。为检测KB细胞对碳点的摄取情况,首先通过荧光显微镜观察各组内绿色荧光细胞的数量,并利用流式细胞术进行定量分析。通过MTT法检测不同浓度的碳点对KB细胞增殖的抑制作用,克隆形成实验检测不同浓度的碳点对KB细胞克隆形成能力的影响。为评价自噬的水平,利用吖啶橙(AO)染色后通过荧光显微镜观察各组细胞中自噬溶酶体数量的变化,同时利用Western Blot对各组细胞中自噬相关蛋白LC3的蛋白水平进行半定量分析。采用Annexin V-FITC/PI双染法经流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。结果:透射电镜下观察所合成的抗坏血酸碳点尺寸平均为5.36 nm,晶格大小平均为0.24 nm。动态光散射测得碳点的水合粒径平均为12.89 nm,电势平均为+8.92 m V。荧光显微镜下观察,40μg/m L碳点处理KB细胞2 h后可见较多的细胞胞浆中出现绿色荧光,流式细胞术结果显示,40μg/m L碳点处理4 h后,与空白对照组相比,绿色荧光细胞的数量显著增加(P0.001),表明抗坏血酸碳点能够被KB细胞摄入。与空白对照组比较,各实验组(即5、10、20、40和80μg/m L碳点组)中KB细胞的增殖率及克隆形成能力均明显降低(分别为P0.01和P0.001)。与空白对照组比较,各实验组KB细胞中自噬溶酶体的数量均有所增加,Western Blot结果显示,仅40μg/m L碳点组细胞内的LC3 II蛋白的水平明显升高(P0.05),表明碳点能够诱导KB细胞发生自噬。此外,40μg/m L碳点组中细胞凋亡率也明显增加(P0.001),表明碳点能诱导KB细胞发生凋亡。与单纯碳点处理组比较,自噬抑制剂3-MA和碳点共处理组中细胞凋亡率明显减少(P0.05),提示自噬能够促进碳点诱导的细胞凋亡。结论:合成的抗坏血酸碳点是平均尺寸为5.36 nm、平均电势为+8.92 m V的球形碳纳米颗粒。抗坏血酸碳点能够被KB细胞摄取,并能够有效地抑制KB细胞的增殖、减弱其克隆形成能力,并诱导KB细胞发生自噬及凋亡。抗坏血酸碳点诱导的自噬能够促进KB细胞的凋亡,提示细胞自噬和凋亡在抗坏血酸碳点杀伤KB细胞的过程中可能起到协同作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.8

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