Biodentine在人牙髓干细胞增殖、迁移、黏附和分化中的作用及其相关机制的研究

发布时间：2018-03-09 23:06

本文选题：Biodentine　切入点：人牙髓干细胞　出处：《第四军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：龋病是口腔的常见病，多发病之一。当龋病发展至牙本质时，细菌及其分泌的毒性产物可通过牙本质小管侵入牙髓组织而导致其不同程度的损伤。当损伤较严重时，原有的成牙本质细胞死亡，牙髓发生炎症，随后牙髓组织中的牙髓干细胞（dentalpulp stem cells, DPSCs）增殖、迁移并黏附于损伤部位分化为成牙本质样细胞（odontoblast-like cells, OBLCs），分泌修复性牙本质，保护牙髓。因此DPSCs增殖、迁移、黏附和成牙/成骨向分化是牙髓损伤修复和治疗的关键环节，这为研究牙髓牙本质复合体的再生提供了重大的契机。 Biodentine是牙髓治疗领域的一种新兴材料。其主要成分为硅酸三钙、碳酸钙、二氧化锆、硅酸二钙、氧化钙、氧化铁、氯化钙和高分子聚合物的还原剂。与三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregate, MTA）相比，Biodentine硬固时间短、微渗漏低和机械性能强。作为盖髓剂能有效地隔绝外界因素刺激，保护牙髓组织，诱导DPSCs分化为OBLCs，形成牙本质样结构，其在牙髓损伤修复过程具有潜在的优势及临床应用前景。那么Biodentine能否诱导人牙髓干细胞的增殖、迁移、黏附和成牙/成骨向分化能力，目前尚未见文献报道。因此，本课题在成功构建hDPSCs细胞系的基础上，研究Biodentine在hDPSCs的增殖、迁移、黏附以及成牙/成骨分化过程中的作用及其相关的分子机制，为将来临床活髓保存治疗和人牙髓干细胞组织工程应用提供新思路。主要的研究结果如下： 1.人牙髓干细胞的分离、培养和鉴定我们选取年轻患者因正畸拔除的新鲜健康第三磨牙，用组织块联合酶消化法分离和培养原代人牙髓细胞，有限稀释法挑选单克隆细胞，，扩大培养获得人牙髓干细胞系。利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行鉴定，同时通过成骨、成脂诱导实验检测细胞的多向分化潜能，证明所培养的细胞为高纯度的人牙髓干细胞。 2. Biodentine对人牙髓干细胞增殖能力的影响制备Biodentine浸提液；通过MTT和BrdU实验检测不同时间点不同浓度Biodentine浸提液（0.02-20mg/ml）刺激二维平面hDPSCs后对其增殖能力的影响。MTT结果显示，不同浓度Biodentine培养hDPSCs1、3、5和7天，0.2mg/ml和2mg/ml的Biodentine均可显著促进该细胞的增殖能力，Biodentine浓度为0.02mg/ml时，细胞增殖与对照组比较没有明显的差异，而20mg/ml的Biodentine显著抑制hDPSCs的增殖，对其有毒性作用。BrdU结果显示，不同浓度Biodentine刺激hDPSCs6、12、24和48小时，其检测结果与MTT结果一致。 3. Biodentine对人牙髓干细胞迁移和黏附能力的影响我们通过细胞划痕和Transwell实验探索Biodentine对hDPSCs迁移的作用；采用细胞黏附实验确定Biodentine对hDPSCs黏附能力的影响；利用实时定量PCR技术进一步分析Biodentine诱导hDPSCs黏附和迁移过程中，细胞趋化因子和黏附分子mRNA表达的情况。通过细胞划痕和Transwell实验，我们发现0.2mg/ml的Biodentine明显促进hDPSCs的迁移能力；细胞黏附实验结果表明Biodentine浓度为0.2mg/ml时能显著提高hDPSCs的黏附作用。此外，实时定量PCR结果显示，0.2mg/ml的Biodentine可有效地影响细胞趋化因子和黏附分子在hDPSCs中的表达。 4. Biodentine在人牙髓干细胞分化中的作用及其相关机制研究首先，用不同浓度Biodentine分别矿化诱导hDPSCs1、3、7、10、14和21天，通过碱性磷酸酶试剂盒检测在细胞分化过程中碱性磷酸酶活性的变化。我们发现0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine组碱性磷酸酶活性明显高于对照组，而且14天时表达达到最高峰，提示Biodentine很可能在hDPSCs成牙/成骨向分化的中后期发挥重要的作用。然后我们通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色和实时定量PCR检测Biodentine对hDPSCs成牙/成骨向分化的影响。结果显示，0.2mg/ml和2mg/ml Biodentine均可促进该细胞向成牙/成骨分化的能力，其中以0.2mg/ml Biodentine更为显著。以上结果证明Biodentine能有效地促进hDPSCs的成牙/成骨向分化，但是相关的分子机制尚不清楚。为了探索Biodentine调控hDPSCs成牙/成骨向分化的分子机制，我们进一步通过茜素红染色、实时定量PCR实验和蛋白质印迹技术，初步探讨如核因子κB（nuclearfactor-kappa B, NF-κB）、钙调素依赖蛋白激酶II（calcium/calmodulin dependent proteinkinase II, CaMKII）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路在Biodentine诱导hDPSCs成牙/成骨向分化过程中的作用。我们发现含有不同通路抑制剂的0.2mg/ml Biodentine矿化诱导hDPSCs14天后，NF-κB抑制剂（PDTC）显著增强Biodentine诱导hDPSCs矿化结节的形成、成牙/成骨基因OCN、DSPP、DMP1及BSP mRNA的表达和相关蛋白的活化，而CaMKII抑制剂（KN-93）和MAPK（ERK和JNK）抑制剂（U0126和SP600125）明显抑制Biodentine诱导该细胞成牙/成骨向分化的能力，此外，MAPK（p38）抑制剂（SB203580）在Biodentine调控hDPSCs成牙/成骨向分化过程中不发挥作用。综上所述，我们的实验证实了一定浓度的Biodentine对人牙髓干细胞的增殖、迁移、黏附和成牙/成骨向分化的能力有着不同程度的影响.进一步研究发现CaMKII和MAPK信号通路参与Biodentine调控人牙髓干细胞的成牙/成骨向分化，并发挥着重要的作用。这为研究人牙髓损伤和修复治疗的分子机制奠定了坚实的基础。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.1

【参考文献】