白介素-17对牙周膜细胞基质金属蛋白酶表达和迁移能力的作用研究

发布时间：2018-03-13 19:04

  本文选题：牙周膜成纤维细胞　切入点：IL-17　出处：《武汉大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牙周膜成纤维细胞是牙周膜的主要细胞类型,它在牙周组织的再生、完整性维持和功能实施过程中发挥重要作用。白介素-17(interleukin-17,IL-17)是目前发现的CD4+T细胞新亚群Th17及其它免疫细胞分泌的一种独特性细胞因子,能够刺激成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和基质细胞等产生多种效应分子发挥广泛的生物学作用。目前研究发现IL-17能通过诱导多种基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)表达从而介导炎症反应、自身免疫与组织改建过程。 MMPs是降解牙周支持组织中细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的重要酶类之一,它与基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)相互作用,协调ECM降解与重建,维持牙周组织结构的完整性和内环境稳定,其中MMP-1在细胞迁移和胞外基质的病理修复过程中发挥关键作用。此外,细胞迁移过程还涉及一系列细胞骨架调控蛋白的合成及重组。但目前IL-17对MMP-1调节方式及其参与调节细胞迁移的分子机制尚未完全明确,,我们推测IL-17可能通过调控牙周膜成纤维细胞表达MMP-1参与牙周组织改建过程。 本课题拟通过体外实验探讨IL-17介导牙周膜细胞表达MMPs及调节细胞迁移的作用方式,并观察人及大鼠根尖周病损中IL-17及MMP-1的相互关系,分析两者在根尖周炎病理过程中的作用。 第一部分：IL-17调控人牙周膜成纤维细胞表达MMPs及依赖的信号通路研究 实验一：IL-17调控人牙周膜成纤维细胞表达MMPs研究 目的：初步探讨IL-17对人牙周膜成纤维细胞表达MMPs、TIMP-1及EMPPRIN的调节作用。 方法：体外培养人牙周膜成纤维细胞,RT-PCR、实时定量RT-PCR、ELISA和明胶酶谱法检测牙周膜成纤维细胞受到IL-17刺激后MMPs、TIMP-1及EMPPRIN的mRNA和蛋白表达水平。 结果：原代培养的人牙周膜成纤维细胞经鉴定证实为中胚层来源。IL-17刺激牙周膜细胞后能显著上调MMP-1和MMP-13的mRNA表达及蛋白分泌水平,同时下调MMP-2、MMP-9和TIMP-1的nRNA表达和蛋白分泌水平。不过,IL-17对EMMPRIN的mRNA表达及蛋白分泌水平无调控作用。 结论：IL-17能调控人牙周膜细胞差异性表达MMPs和TIMP-1,推测这一现象可能参与牙周炎症及组织改建过程。 实验二：IL-17调控人牙周膜成纤维细胞表达MMP-1及所依赖的信号通路研究 目的：观察IL-17调控人牙周膜细胞表达MMP-1的作用机制,探讨其所依赖的信号通路。 方法：体外培养人牙周膜细胞,实时定量RT-PCR、ELISA和Western blotting观察IL-17刺激后MMP-1的mRNA和蛋白活性的表达水平；细胞免疫荧光染色定位人牙周膜细胞表达MMP-1的情况；Western blot检测IL-17激活的信号通路情况；采用信号通路抑制剂和RNA沉默技术筛选参与IL-17介导MMP-1表达上调的信号通路分子；凝胶电泳迁移率实验检测转录蛋白和目的基因的相互作用。 结果：IL-17刺激牙周膜细胞上调MMP-1的mRNA和蛋白表达水平呈时间-浓度依赖性,且MMP-1前体和活性成分的表达强度均升高。IL-17受体的中和抗体可阻断IL-17介导的MMP-1高表达。IL-17刺激牙周膜细胞后,p38-MAPK、 ERK1/2、JNK及Akt等信号激酶发生磷酸化,胞内NF-κBp65发生核转位。在IL-17刺激牙周膜细胞前用各种信号通路抑制剂预处理,发现p38-MAPK抑制剂(SB203580)和NF-κB抑制剂(PDTC)预处理后MMP-1的表达水平降低。细胞转染p38α siRNA能抑制IL-17介导的MMP-1高表达。此外,p38α siRNA还能抑制IL-17诱导后的NF-κB转核及与目的基因的结合力。 结论：IL-17诱导牙周膜细胞表达MMP-1依赖IL-17与IL-17R的相互作用,及p38-MAPK/NF-κB信号通路。 第二部分：IL-17调节人牙周膜细胞迁移及其作用方式的研究 实验三：IL-17调节人牙周膜细胞迁移及其作用方式的研究 目的：观察IL-17对牙周膜细胞增值及迁移的影响,检测IL-17调节牙周膜细胞内骨架的改变,探讨影响牙周膜细胞迁移的信号通路。 方法：体外培养人牙周膜细胞,CKK-8和划痕实验分别检测IL-17诱导牙周膜细胞的增值和迁移情况；加入IL-17受体的中和抗体、TIMP-1、转染MMP-1siRNA或p38α siRNA检测IL-17介导细胞迁移的变化；细胞染色定位IL-17刺激前后细胞内纤维状肌动蛋白(F-actin)形成和胞内骨架变化；免疫荧光双染共定位磷酸化paxillin和F-actin的位置及分布；Western blotting检测IL-17激活的粘附斑激酶(FAK)磷酸化情况。 结果：IL-17刺激能促进牙周膜细胞迁移但对细胞增值无影响。加入IL-17受体的中和抗体、TIMP-1、转染MMP-1siRNA或p38α siRNA均能抑制IL-17介导下的细胞迁移。IL-17能促进细胞内骨架改建,包括F-actin骨架重排、肌应力纤维束形成及板状伪足伸出,这一过程能被MMP-1siRNA和p38抑制剂所阻断。 此外,IL-17还能促进细胞磷酸化paxillin向细胞膜和肌动蛋白细丝顶端移动聚集 以及激活粘附斑激酶(FAK)磷酸化。当加入p38抑制剂后IL-17介导下的细胞 内骨架改建和磷酸化paxillin组装受到抑制。 结论：IL-17促进牙周膜细胞迁移依赖p38-MAPK活化的MMP-1高表达,迁移 过程中IL-17介导的细胞骨架和粘附斑重组需要MMP-1的参与；FAK磷酸化和 p38-MAPK共同调节黏着斑的分布组装,IL-17可能通过调控p38-MAPK、FAK 和MMP-1参与的细胞骨架改建最终导致牙周膜细胞的迁移。 第三部分：IL-17和MMP-1在人及大鼠根尖周病变的表达情况研究 实验四：IL-17和MMP-1在人慢性根尖周病变的表达情况研究 目的：检测在人慢性根尖周病变IL-17和MMP-1的表达情况,分析两者表达的 相互关系。 方法：从2013年1月至8月在武汉大学口腔医院牙体牙髓科行根尖手术或颌面 外科拔牙患者中,收集到人慢性根尖周炎病损组织15例(其中根尖周肉芽肿10 例,囊肿5例)及正常根尖周组织标本4例。7例根尖周病损标本用于组织学、 免疫组化和免疫荧光染色研究,以观察IL-17和MMP-1的表达情况。另外8例 根尖周病损标本及4例正常根尖周组织标本采用实时定量RT-PCR方法检测 IL-17和MMP-1mRNA表达,并分析IL-17与MMP-1表达量之间的关系。 结果：免疫组化结果显示IL-17和MMP-1均表达于人慢性根尖周肉芽肿及囊肿 中。免疫荧光染色指示表达IL-17与MMP-1的细胞存在不同,前者主要定位于 淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞等,后者除定位于炎性细胞外,还(?)成纤维样 细胞和血管内皮细胞上表达。此外,实时定量RT-PCR结果发现在两者mRNA 的表达水平均高于正常对照组,且IL-17在根尖肉芽肿的表达量稍高于根尖周囊 肿,而MMP-1在根尖周囊肿的表达量则略高,但无统计学意义,IL-17表达与 MMP-1表达呈正相关。 结论：IL-17与MMP-1共同参与根尖周炎慢性期炎症,提示两者参与了慢性炎 症的发展过程。 实验五：IL-17和MMP-1在大鼠根尖周病变的表达情况研究 目的：检测在大鼠根尖周病变IL-17和MMP-1的表达情况,探讨两者在病变发 展过程中的相互关系。 方法:将30成年雄性Sprague-Dawle大鼠开髓,分别于术后0、7、14、21、28 和35天取下颌骨,制备组织切片。HE染色观察根尖周病变中炎症变化：免疫组 织化学检测IL-17和MMP-1的表达与变化,并用胶原染色分析根尖周基质纤维变化。 结果：在大鼠根尖周炎模型中,正常组根尖周组织未见炎性细胞和IL-17及MMP-1阳性细胞,胶原纤维排列整齐；术后7天组根尖周可见少量炎性细胞浸润,并有少量IL-17阳性细胞和MMP-1阳性细胞出现；术后14天IL-17阳性细胞和MMP-1阳性细胞增多,胶原结构紊乱；术后21～28天,IL-17的表达量继续增加,至21天达到峰值,MMP-1阳性细胞和中性粒细胞也持续增加；术后28-35天,IL-17及MMP-1阳性细胞数量恒定,有新生胶原合成,根尖周炎症进入慢性期阶段。IL-17阳性细胞和MMP-1阳性细胞数与根尖周炎进展相关,且IL-17和MMP-1的表达呈正相关。 结论：IL-17与MMP-1共同参与根尖周炎急性及慢性期炎症,提示两者在疾病的发生、发展及转归等病理过程中的起到一定作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.34

【共引文献】

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本文编号：1607716