GnRH及其类似物通过受体对口腔癌细胞的作用研究

发布时间：2018-03-18 20:15

本文选题：促性腺激素释放激素受体　切入点：曲普瑞林　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:目前已知有多种癌细胞表面存在I型促性腺激素释放激素受体(Gn RHR-I),但国内外尚未见有关于口腔癌细胞或组织表达Gn RHR-I的报道,并且多数学者认为肿瘤细胞表面Gn RHR-I与其在下丘脑-垂体-性腺轴的细胞内所介导的信号转导机制不同。因此本研究选取口腔癌KB细胞株,验证其Gn RHR-I基因及蛋白的表达,并通过细胞增殖抑制实验、Real-Time PCR、Western Blot、i TRAQ等实验方法希望解释体内激素水平影响肿瘤组织的生长状态及找到口腔癌细胞表面Gn RHR-I的存在意义。方法:1.RT-RCR方法及电泳后切胶回收测序方法基因水平验证KB细胞存在Gn RHR-I m RNA表达,Western Blot方法蛋白水平证实KB细胞存在Gn RHR-I蛋白表达。2.利用CCK-8试剂盒检测不同浓度(10、20、40、80μg/ml)Gn RH-I及Triptorelin处理KB细胞48小时后450 nm处吸光值并计算存活率。3.荧光定量PCR方法对CAL-27、SCC-4、KB三株口腔癌细胞Gn RHR m RNA表达水平进行相对鉴定。4.荧光定量PCR方法检测Gn RH-I及Triptorelin处理KB细胞48小时对细胞Gn RHR-I表达水平的影响,检测Triptorelin处理KB细胞12、24、36、48小时对细胞Gn RHR-I m RNA表达水平的影响。5.同位素标记相对和绝对定量(i TRAQ)方法解析Triptorelin处理KB细胞48小时后与对照组相比较的差异蛋白表达谱,并做GO、KEGG分析获得代谢通路变化情况。结果:1.经琼脂糖凝胶电泳并进行切胶回收测序检测显示KB细胞Gn RHR-I基因扩增结果正确。Western Blot结果显示,KB细胞蛋白在60k Da处存在Gn RHR-I特异性反应条带。2.Gn RH-I处理KB细胞48小时后酶标仪检测450nm处吸光值,对照组、10、20、40、80μg/ml处理组吸光值分别为1.475±0.017、1.455±0.013、1.437±0.017、1.418±0.016、1.392±0.019,存活率分别为100.00±0.013%、98.537±0.009%、97.186±0.012%、95.784±0.012%、93.860±0.014%。10μg/ml Gn RH处理KB细胞48小时与对照组相比,细胞存活率无统计学差异(p=0.171),20μg/ml组与对照组相比存活率有显著差异(p=0.018),40、80μg/ml处理组与对照组相比存活率差异有极显著性(p=0.002,p=0.0001)。Triptorelin处理KB细胞48小时对照组、10、20、40、80μg/ml组吸光值分别为1.475±0.017,1.444±0.019,1.429±0.023,1.401±0.018,1.332±0.032。细胞存活率分别为100.00±0.013%,97.701±0.014%,96.431±0.017%,94.507±0.013%,89.485±0.024%。10μg/ml Triptorelin处理KB细胞48小时与对照组相比,存活率无统计学差异(p=0.118),20μg/ml Triptorelin组与对照组相比存活率有显著差异(p=0.022),40、80μg/ml Triptorelin处理组与对照组相比存活率差异有极显著性(p=0.002,p=0.0001)。相同浓度组间比较显示,Gn RH-I与曲普瑞林对KB细胞增殖抑制能力均无差异(p0.05)。3.对三株口腔癌细胞CAL-27、SCC-4、KB的相对定量分析显示,KB细胞Gn RHR-I m RNA表达量为SCC-4的1.810±0.049倍(p0.01),人舌鳞癌细胞株CAL-27的Gn RHR-I表达水平在三种细胞中最高,为SCC-4的3.564±0.066倍(p0.0001)。4.荧光定量PCR结果显示,Gn RH-I处理KB细胞48小时后Gn RHR-I m RNA表达量为对照组的0.256±0.023倍(p0.01),Triptorelin处理组m RNA表达量为对照组的0.117±0.013倍(p0.01),Triptorelin显示对KB细胞Gn RHR-I m RNA的表达有更强的抑制能力(p0.01)。Triptorelin处理KB细胞12、24、36、48小时的m RNA表达水平分别为对照组的0.926±0.021倍(p=0.186)、0.565±0.016倍(p0.01)、0.250±0.022倍(p0.01)、0.175±0.034倍(p0.0001),24、36、48小时组与对照组相比较差异具极显著意义(p0.01)。5.基于i TRAQ技术的曲普瑞林对KB细胞抑制作用的蛋白组学分析显示KB细胞差异蛋白数共58个点,上调14个,下调44个(p0.05)。差异蛋白经GO与KEGG分析主要与蛋白酶体下调有关(p0.01)。结论:1.口腔癌KB细胞株促性腺激素释放激素受体基因及蛋白检测呈阳性。2.Gn RH-I和Triptorelin能够抑制KB细胞增殖。随Gn RH-I和Triptorelin浓度增加,细胞存活率逐渐降低,相同浓度的Gn RH-I和Triptorelin对细胞的增殖抑制能力无差异。3.人舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27在SCC-4、CAL-27、KB三株口腔癌细胞中Gn RHR-I m RNA表达量最高,SCC-4最低。4.Gn RH-I和Triptorelin均能够下调KB细胞的Gn RHR-I m RNA表达水平,其中Triptorelin显示更强的下调KB细胞Gn RHR-I m RNA能力。Triptorelin下调KB细胞Gn RHR-I m RNA表达具有时间依赖性。5.曲普瑞林对KB细胞的增殖抑制作用机制为对蛋白酶体亚单位等关键蛋白下调,干扰细胞内蛋白降解,从而抑制细胞增殖,显示曲普瑞林作为一种蛋白酶体抑制剂抑制细胞增殖。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.8

【参考文献】