炎症微环境下低强度脉冲超声辐照对人牙周膜细胞炎症因子表达及成骨分化能力影响的初步研究

发布时间：2018-03-26 04:03

  本文选题：低强度脉冲超声　切入点：人牙周膜细胞　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文

【摘要】：牙周炎是一种慢性感染性疾病,累及牙齿及牙周组织(包括牙龈、牙周膜、牙槽骨及牙骨质)。常规的牙周治疗主要是通过手术或非手术的方法,彻底清除局部刺激因素,阻止牙周炎的发生发展,同时创造有利的牙周微环境以期牙周组织再生。低强度脉冲超声(Low-Intensity Pulsed Ultrasound,LIPUS)作为一种安全无创的治疗方式,有研究报道LIPUS辐照具有有效的抑制炎症及促进成骨的作用。但其在牙周领域对牙周炎症的抑制作用及促进炎症环境下成骨的研究尚较缺乏。基于课题组前期研究,我们猜测LIPUS辐照可能通过抑制牙周炎症微环境从而增强炎症环境下人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,h PDLCs)的成骨分化能力。本实验建立在前期动物实验已证实LIPUS辐照急性牙周缺损可增强组织新骨形成及文献报道LIPUS对炎症环境下成骨相关细胞的炎症抑制作用的基础上,通过牙龈普林单胞菌(P.gingivalis,Pg.)来源的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导h PDLCs模拟牙周炎症微环境,并采用LIPUS对炎症微环境下的h PDLCs进行辐照,以探究LIPUS在牙周炎症微环境中的应用。Pg.LPS作为牙周炎最重要的致病因素和公认的炎症启动因子,可较好的模拟体外牙周炎症微环境。LIPUS是以脉冲式、低强度超声波的形式应用于体内及体外研究,已被证实具有增强细胞增殖活性,促进细胞成骨分化、抑制炎症因子分泌表达等作用。本实验设计共分为以下五个部分:第一部分人牙周膜细胞的分离培养及生物学特性鉴定目的:体外分离、培养h PDLCs,对细胞进行鉴定,为后续实验奠定基础。方法:采用组织块法+酶消化法从前磨牙分离、培养原代h PDLCs并进行传代培养。人波形丝蛋白(vimentin)、人角蛋白(CK14)染色鉴定细胞来源;流式细胞术检测细胞表面标记物表达;成骨、成脂、成软骨培养基体外诱导培养h PDLCs,第21天后检测多向分化能力。结果:传至第3代的h PDLCs形态均一,呈长梭形,为典型成纤维样细胞。人波形丝蛋白(vimentin)染色阳性,人角蛋白(CK14)染色阴性。间充质干细胞特异性表面抗原表达CD73:99.88%,CD146:71.6%,Strol-1:1.21%,CD34:0.62%。成骨、成脂、成软骨培养基体外诱导培养h PDLCs第21天后,茜素红S染色阳性,阿利新蓝染色阳性,油红O染色阳性。结论:本实验成功培养出间充质来源的h PDLCs,其中含有较多的间充质干细胞成份,细胞增殖能力较强,具有多向分化潜能,可用于后续实验研究。第二部分炎症微环境下低强度脉冲超声辐照对人牙周膜细胞表达IL-6、IL-8抑制作用的研究目的:研究LIPUS辐照LPS刺激的h PDLCs,检测炎症因子IL-6、IL-8的表达变化,筛选LIPUS的最适辐照参数,探究LIPUS对炎症因子IL-6、IL-8表达的抑制作用及其辐照的安全性。方法:1 ug/ml LPS刺激h PDLCs 24h模拟牙周炎症微环境,选用10、30、60、90 m W/cm2四个LIPUS辐照强度分别对处理的细胞连续辐照2h,探究LIPUS对炎症因子IL-6、IL-8表达的抑制作用并筛选LIPUS最适辐照参数。具体检测方法包括:ELISA检测IL-6、IL-8蛋白表达水平变化;q PCR检测IL-6、IL-8基因表达水平变化;CCK-8检测LIPUS辐照对细胞增殖活性影响;流式细胞术检测LIPUS辐照对细胞凋亡影响。结果:ELISA和q PCR检测结果表明30、60、90 m W/cm2LIPUS辐照对IL-6、IL-8的蛋白分泌及基因表达均具有明显抑制作用(p0.05),且90m W/cm2LIPUS辐照强度对炎症抑制作用最强,因此对90m W/cm2 LIPUS辐照强度的安全性进行后续研究。CCK-8检测细胞增殖活性表明90m W/cm2LIPUS辐照不会导致细胞死亡且对细胞增殖具有一定促进作用(p0.05),流式细胞检测证实90m W/cm2 LIPUS辐照对细胞的凋亡具有一定抑制作用(p0.05)。结论:LIPUS辐照能有效抑制炎症因子IL-6、IL-8的分泌表达。90m W/cm2 LIPUS对IL-6、IL-8的抑制作用最明显,且对细胞无有害作用,能增强细胞增殖活性、抑制细胞凋亡,因此,我们选用90m W/cm2强度作为LIPUS最适辐照强度。本部分实验证实LIPUS可作为一种安全有效的辐照方式应用于探究LIPUS辐照对微环境下h PDLCs的炎症因子分泌及成骨分化能力影响的后续研究中。第三部分炎症微环境下低强度脉冲超声辐照对人牙周膜细胞NF-κB炎症信号通路的影响及机制研究目的:NF-κB信号通路作为与牙周炎关系最密切的信号通路,本部分实验研究LIPUS辐照抑制LPS刺激模拟的牙周炎症微环境下IL-6、IL-8表达与NF-κB信号通路相关的分子机制。方法:1ug/ml LPS刺激h PDLCs 24h模拟牙周炎症微环境,选用90 m W/cm2 LIPUS辐照强度对处理的细胞连续辐照2h,Western Blot(WB)检测NF-κB信号通路IκBα、p-IκBα、胞浆胞核p65变化;免疫荧光检测NF-κB信号通路的p65入核情况。结果:WB检测IκBα、p-IκBα、胞浆胞核p65结果提示LIPUS辐照有效抑制LPS刺激的h PDLCs的NF-κB信号通路;免疫荧光检测NF-κB信号通路的p65入核情况表明LIPUS辐照后,p65入核较LPS组减少,说明LIPUS可通过抑制NF-κB信号通路从而抑制IL-6、IL-8表达。结论:在LPS模拟的炎症微环境下,LIPUS辐照可有效抑制NF-κB炎症信号通路,从而改善炎症微环境。第四部分炎症微环境下低强度脉冲超声辐照对人牙周膜细胞成骨分化能力影响的研究目的:炎症微环境下h PDLCs成骨分化能力下降,在成骨诱导条件下模拟炎症微环境并予以LIPUS辐照,研究LIPUS辐照能否通过抑制炎症因子的分泌提高h PDLCs的成骨分化能力。方法:1ug/ml LPS刺激成骨诱导条件下h PDLCs,90m W/cm2 LIPUS进行辐照,30min/天,连续辐照7天后对细胞进行相关检测。具体检测方法包括:q PCR检测IL-6、IL-8基因表达水平及成骨相关基因RUNX2、OPN、OSX、OCN的表达水平;碱性磷酸酶染色及定量分析;CCK-8检测细胞增殖活性。结果:LIPUS连续辐照7天后,q PCR检测IL-6、IL-8的基因水平表明90m W/cm2LIPUS+LPS+OM组IL-6、IL-8基因表达水平比LPS+OM组降低(p0.01),表明LIPUS连续辐照可抑制IL-6、IL-8的表达;q PCR检测成骨相关基RUNX2、OPN、OSX、OCN发现LPS+LIPUS(90m W/cm2)+OM组成骨相关基因的表达水平均较LPS+OM组增加(p0.05),表明LIPUS连续辐照能增强炎症为环境下h PDLCs的成骨基因表达;碱性磷酸酶染色及定量分析结果显示LPS+LIPUS(90m W/cm2)+OM组较LPS+OM组成骨分化能力更强(p0.05);CCK-8检测细胞增殖活性表明LIPUS连续辐照对细胞增殖活性无有害影响。结论:LIPUS辐照LPS刺激的成骨诱导条件下h PDLCs发现,LIPUS连续辐照可有效抑制炎症因子IL-6、IL-8表达,同时增强h PDLCs在炎症微环境下的成骨分化能力。第五部分炎症微环境下低强度脉冲超声辐照对人牙周膜细胞成骨分化能力影响与NF-κB炎症信号通路的关系及机制研究目的:探究LIPUS抑制炎症因子IL-6、IL-8表达从而增强h PDLCs在成骨诱导环境下的成骨分化能力与NF-κB信号通路的关系及其分子机制,并采用NF-κB信号通路抑制剂进一步证实。方法:WB检测LIPUS辐照炎症微环境下h PDLCs的NF-κB信号通路IκBα、p-IκBα、胞浆胞核p65蛋白变化。采用NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082抑制NF-κB信号通路后,90m W/cm2 LIPUS辐照炎症微环境下h PDLCs,连续辐照(30min/天)7天后对细胞进行相关检测。具体检测包括:q PCR检测成骨相关基因RUNX2、OPN、OSX、OCN基因表达水平;碱性磷酸酶染色及定量分析;WB检测NF-κB信号通路IκBα、p-IκBα、胞浆胞核p65蛋白变化。结果:LIPUS辐照LPS刺激下成骨诱导的h PDLCs,WB结果显示LIPUS连续辐照能有效抑制NF-κB信号通路。分别加入BAY 11-7082抑制剂或予以LIPUS辐照后,q PCR结果表明RUNX2、OPN、OSX、OCN的基因表达水平较LPS组增强(p0.05)。碱性磷酸酶染色及定量分析结果显示也证明BAY11-7082抑制NF-κB信号通路及LIPUS连续辐照h PDLCs的成骨分化能力较LPS组更强(p0.05)。WB结果证实LIPUS起着类似BAY11-7082剂的作用有效抑制NF-κB信号通路。结论:LIPUS连续辐照能够有效抑制NF-κB信号通路。使用抑制剂BAY-11-7082阻断NF-κB信号通路发现,抑制NF-κB信号通路可促进炎症微环境下h PDLCs的成骨分化能力,说明NF-κB信号通路参与调控炎症环境下h PDLCs的成骨分化,且通过抑制NF-κB信号通路可增强h PDLCs的成骨分化能力。本部分研究证实LIPUS辐照通过抑制炎症微环境中的NF-κB信号通路提高炎症环境下h PDLCs的成骨能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.4

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