自噬在牙发育及牙髓再生中的作用

发布时间：2018-04-01 06:28

本文选题：自噬　切入点：凋亡　出处：《武汉大学》2014年博士论文

【摘要】：第一部分小鼠牙胚发育中自噬的时空性表达模式分析目的：自噬是一种由溶酶体和胞内体介导的细胞自我降解过程,在细胞增殖、分化和死亡过程中发挥重要作用。近来研究表明,自噬与凋亡紧密关联参与胚胎的发育过程。本研究旨在探索小鼠牙胚发育中自噬的时空性表达模式,并初步分析其与凋亡的相关性。方法：收集不同发育时期的小鼠下颌第一磨牙牙胚,实时定量RT-PCR和Westernblot分析自噬相关分子的mRNA和蛋白表达水平；免疫组织化学定位自噬相关蛋白LC3和Beclin1；自噬及凋亡相关分子免疫荧光双标及三标技术共定位(LC3/TUNEL; LC3/Beclinl/Cl-Caspase-3)分析自噬和凋亡的位置关系；进一步通过透射电镜观察自噬小体与凋亡的超微结构及其定位分布。结果：实时定量RT-PCR和Western blot结果显示,在小鼠牙胚发育的不同时期均有自噬相关基因(Atg5, Atg7, Atg12)和蛋白(Atg5-Atg12复合物,Beclin1的全片段及剪切片段及LC3Ⅱ)的表达。免疫组织化学分析表明,在牙胚发育的不同时期,LC3定位于牙胚的不同部位。在胚胎期,LC3在成釉器和牙乳头均有表达,尤其是E14.5时期的颈环和原发性釉节(PEK)面向间充质的部分；而出生后期,LC3则主要表达于成釉器、成牙本质细胞、牙囊细胞及Hertwig's上皮根鞘。与此同时,Beclin1的表达模式与LC3不完全一致,主要体现在Beclin1有部分胞核表达,并且其在胚胎期主要分布于成釉器。免疫荧光双标捕获LC3和TUNEL信号存在部分共定位,主要在E14.5的PEK、E16.5的中间层和外釉上皮、P5.5的中间层和星网状层。免疫荧光三标发现在E14.5原发性釉节中,Beclin1、LC3和C1-Caspase-3相互存在部分共定位,且其中存在Beclin1+LC3+Caspase-3+三阳性的细胞。透射电镜观察进一步证实,在E14.5的原发性釉节和P5.5的星网状层,均可见部分自噬小体和凋亡细胞核有共定位。结论：自噬存在于小鼠牙胚发育的过程中,且与凋亡存在部分共定位,推测其可能通过Beclin1与凋亡相互作用,共同调控牙形成。本研究为进一步阐明牙发育的机制提供了基本资料。第二部分自噬参与SDF-1a介导的牙髓干细胞迁移及异位牙髓再生目的：基于再生医学的发展,牙髓根尖周病治疗衍生出“牙髓再生治疗”理念：即构建具有生物活性的牙髓组织,恢复牙体组织的生命和活力。SDF-1α隶属于CXC趋化因子亚家族,在造血干细胞和间充质干细胞的募集、迁移以及分化中发挥关键作用。近来研究发现,SDF-1α可促进犬牙髓干细胞迁移,并且胶原负载SDF-1α整合犬牙髓干细胞(Denal pulp stem cells, DPSCs)可有效实现牙髓再生。但有关SDF-1α介导牙髓再生的机制尚不明确。第一部分实验结果显示自噬存在于发育中的牙乳头和成牙本质细胞中,提示自噬可能参与牙髓再生。本实验旨在探讨自噬对SDF-1α介导DPSCs迁移的调控效应；进一步应用丝素蛋白支架负载SDF-1α并整合DPSCs建立异位牙髓再生模型,探讨自噬在再生牙髓样组织中的表达及作用。方法：有限稀释法原代培养人牙髓干细胞,克隆形成试验、细胞免疫荧光、流式细胞术和多向分化检测鉴定其干细胞特性。CCK8、划痕和Transwell试验,检测SDF-1α对DPSCs细胞活力和迁移的影响；细胞免疫荧光检测SDF-1α刺激下DPSCs细胞骨架和黏着斑蛋白的改变。细胞免疫荧光、Western blot及透射电镜检测SDF-1α对DPSCs自噬表达水平的影响,并应用自噬抑制剂及激活剂探讨自噬对SDF-1α介导DPSCs迁移的调控效应。冷冻干燥法制取多孔丝素蛋白支架并负载SDF-1α,扫描电镜和傅里叶红外光谱检测其表面形貌及物理化学特征。通过将支架整合经过预处理的牙根段(牙根段-丝素蛋白支架复合体)以模拟牙髓微环境,接种DPSCs后,体外培养后扫描电镜观察细胞的形态或裸鼠皮下移植,建立异位牙髓再生模型。HE、Masson三色法、苦昧酸-天狼星红染色、、Vestern blot、免疫组织化学以及免疫荧光对再生组织进行组织学形态及增殖、成血管、成神经、成骨、成牙相关指标检测。Western blot、免疫组织化学、透射电镜以及免疫荧光共定位进一步检测自噬相关分子及其与血管内皮标记分子的共定位特点。结果：分离培养的DPSCs表达间充质干细胞表面标记、具有克隆形成能力以及多向分化潜能。SDF-1α(0-200ng/ml)对DPSCs的细胞活力基本无影响。值得注意的是,SDF-1α可剂量依赖性促进DPSCs迁移,伴随细胞骨架改建以及黏着斑组装(Vincullin, p-Paxillin, p-FAK)。与此同时,SDF-1α可激活DPSCs自噬相关蛋白(Beclin I, LC3, Atg5-Atg12复合体)表达及自噬小体的形成。并且,在SDF-1α刺激DPSCs前用自噬抑制剂或激活剂预处理,发现自噬抑制剂(3-MA,氯喹)预处理,可不同程度阻断SDF-1α激发的DPSCs迁移；而自噬激活剂(Rapamycin)预处理则使DPSCs迁移水平进一步提升。丝素蛋白支架孔径约为200±46μm,负载SDF-1α后并未改变支架的分子构象。DPSCs在上述支架可表现良好的铺展形态、增殖并伴随细胞外基质的分泌。牙根段-负载SDF-1α的丝素蛋白支架复合体整合人牙髓干细胞在裸鼠皮下可形成牙髓样组织,表现为富含血管和类似正常牙髓的新生胶原纤维形成,且牙本质壁沉积有DSP表达阳性的新生矿化组织。值得注意的是,再生组织中存在自噬及相关分子(Atg5,LC3)表达和自噬小体的形成。此外,LC3和血管内皮标记分子CD31呈现部分共定位的特征,且血管内皮超微结构中可见自噬小体的存在,提示自噬可能参与了异位再生牙髓组织的成血管过程。再生牙髓样组织由供体细胞和宿主细胞共同组成,且在无细胞移植组,SDF-1α亦可有效募集宿主细胞形成含有血管和新生胶原纤维的结缔组织,伴随自Atg5和LC3的表达。结论：丝素蛋白支架负载SDF-1α可有效实现异位牙髓再生；自噬可能通过正向调控SDF-1α介导的DPSCs迁移及参与自体干细胞募集参与牙髓再生的过程。第三部分“干细胞归巢”下SDF-1α介导的犬成熟恒牙原位牙髓再生及自噬表达相关研究目的：“干细胞归巢”模式,即通过有效募集机体内源性干细胞作为种子细胞,从而实现组织/器官再生。最近有学者提出基于“干细胞归巢”可初步实现犬成熟恒牙原位牙髓再生,然而其再生组织呈现广泛弥散性钙化,与正常牙髓相去甚远。我们第二部分中的结果初步提示,在无DPSCs移植情况下,SDF-1α可通过募集宿主细胞在牙根段内生成富含血管和胶原的结缔组织。本实验旨在基于“干细胞归巢”模式,进一步探索建立SDF-1α介导的犬成熟恒牙原位牙髓再生模型,比较研究其再生组织与正常牙髓的形态特点以及自噬相关分子表达水平。方法：选取比格犬根尖孔闭合恒牙,牙髓暴露法诱导根尖周炎,根管预备消毒后针扎根尖出血,移植入负载SDF-1α的丝素蛋白支架,以单纯针扎出血诱导根管内形成血凝块为对照,建立成熟恒牙牙髓原位再生模型。HE、Masson三色法和苦味酸-天狼星红染色分析再生组织形态特点；免疫组织化学染色进一步检测自噬相关分子LC3和Atg5的表达。结果：在犬成熟恒牙原位牙髓再生模型中,血凝块对照组和负载SDF-1α的丝素蛋白支架组根管内均可见到组织形成,含部分炎性细胞。血凝块对照组再生组织中主要为沿牙本质壁形成的较厚的牙骨质样组织,髓腔内有大小不一的骨样组织及少量含有小血管的结缔组织。负载SDF-1α的丝素蛋白支架组再生组织为牙髓样组织,表现为血运较丰富的结缔组织,胶原纤维排列方式与正常牙髓类似,髓腔内未见骨样组织,沿牙本质壁形成较薄的矿化组织。而矿化组织表面可见排列均匀的单层细胞,并有纤维样结构深入其中。此外,在犬正常牙髓中,Atg5基本无表达,LC3仅表达于成牙本质细胞；而在再生组织中,Atg5和LC3均有表达,且负载SDF-1α的丝素蛋白支架组表达水平高于血凝块对照组。结论：基于“干细胞归巢”模式,丝素蛋白支架负载SDF-1α可有效实现原位牙髓再生,再生组织与正常牙髓类似,并伴随自噬相关分子表达升高。本研究将为牙髓再生的临床转化提供依据。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.3

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