同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨修复比格犬半侧下颌骨缺损的实验研究

发布时间：2018-04-02 21:05

本文选题：同种异体　切入点：冻干下颌骨　出处：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文

【摘要】：【研究背景】由于外伤、肿瘤、先天性畸形、感染等原因造成的下颌骨缺损重建是临床上常见的问题。下颌骨上附着有大量的肌肉、韧带组织，是面部唯一能活动的骨骼，它的结构较为复杂，是面下1/3外形轮廓的主要组成部分，与说话、咀嚼、吞咽等口腔功能密切相关。下颌骨的缺损不仅影响患者的容貌外形，而且严重影响患者的心理健康。大段下颌骨的缺损修复一直是口腔颌面外科医生所面临的一大难题。自体骨移植修复下颌骨缺损的效果较好，但是外形欠佳、骨量有限，无法满足较大缺损的修复，而且自体骨移植常常造成供区解剖结构和功能的损害，增加了患者的痛苦。因此，这就需要我们去寻求新的修复重建方法。近年来骨组织工程的发展为下颌骨缺损的修复重建提供另一方法，但目前骨组织工程所用支架强度难以达到临床要求，同时也较难恢复下颌骨形态。【目的】为了解决大段下颌骨缺损重建的修复难题，通过建立比格犬半侧下颌骨缺损的动物模型，运用组织工程的原理和方法，创新性的提出以同种异体冻干下颌骨为支架材料复合同种异体骨髓间充质干细胞修复大段下颌骨缺损的重建方案，探索大段下颌骨缺损修复的新方法，为临床大段下颌骨缺损修复提供实验依据。【方法】 1.切取比格犬右侧下颌骨，剥离附着的软组织，进行冲洗、脱脂、冷冻及冻干处理，经辐照灭菌后，常温保存。通过组织学、扫描电镜及生物力学弯曲及压缩试验进行检测； 2.分离培养雄性比格犬骨髓间充质干细胞，体外扩增培养，向成骨、成脂方向诱导分化，并通过流式细胞仪对分离的骨髓间充质干细胞的表面标志物进行鉴定。将冻干骨片与骨髓间充质干细胞共培养，通过MTT绘制生长曲线，观察冻干骨对细胞增殖的影响，并用扫描电镜观察细胞在冻干骨表面的生长情况； 3.手术拔除比格犬右侧下颌牙齿，2个月后从口外切口，进行半侧下颌骨切除，采用同种异体冻干骨和自体骨修复缺损，术后3个月通过CT扫描及大体观察进行评估，建立下颌骨缺损重建的动物模型； 4.通过雄性犬的骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨移植到雌性比格犬体内异位移植，采用原位杂交的方法示踪移植的干细胞在移植骨组织内的存活情况，探讨同种异体干细胞的作用机制； 5.正常下颌骨与单纯同种异体下颌骨、冻干骨复合自体骨髓间充质干细胞及冻干骨复合同种异体间充质干细胞移植修复比格犬半侧下颌骨缺损进行比较，术后1、3、6月通过CT扫描、大体观察、组织学检测、Micro-CT骨密度检测及外周血白介素2、4、6的水平，比较正常下颌骨与其他三组的修复效果及免疫学反应；6.自2008年1月～2014年1月,我们采用同种异体冻干下颌骨复合自体骨髓对25例大段下颌骨缺损的患者进行修复手术，术后随访最长6年，术后通过CT、全口曲面断层片、ECT骨三项、体格检查进行评估； 7.构建了数字化外科平台，并对运用数字化外科平台对2005年1月至2014年1月在我院口腔颌面外科就诊的颌面部缺损、畸形患者进行的颌骨缺损畸形整复手术进行回顾性分析。【结果】 1.同种异体冻干骨内部无细胞成分，冻干法对骨组织结构没有明显破坏。弯曲实验的冻干骨的最大载荷486.67±134.12N、最大位移0.67±0.15mm和刚度1151.67±256.46N.mm-1。新鲜骨的最大载荷688.97±92.07N、最大位移1.05±0.11mm和刚度791.83±177.79N.mm-1。新鲜组的最大载荷和最大位移显著高于冻干组(P 0.01)而刚度显著低于冻干组(P 0.05)。压缩试验中，新鲜骨压缩实验的最大载荷5079.5±1014.98N、最大位移1.01±0.16mm和刚度9837.83±1580.63N.mm-1。冻干骨压缩实验的最大载荷5163.10±730.16N、最大位移0.78±0.19和刚度11069.17±1758.12N.mm-1。压缩实验的断裂部位在舌侧骨皮质相对薄弱处。压缩实验结果显示新鲜组与冻干骨的最大载荷、刚度相比无显著性差异（P0.05）,而新鲜组的最大位移显著高于冻干组(P 0.05)； 2.骨髓间充质干细胞第1、3、6代细胞之间的细胞增殖无显著性差异，骨髓间充质干细胞流式细胞表面标志物检测之后，CD90、CD105、CD73呈阳性，CD45、CD34、 CD31、 CD14和HLA-DR呈阴性，表现出间充质干细胞的特点。扫面电镜可见细胞贴敷于骨组织表面生长，细胞生长曲线显示同种异体冻干骨对同种异体骨髓间充质干细胞的增殖影响不大； 3．通过CT扫描及大体观察，自体骨与同种异体冻干骨能够修复比格犬半侧下颌骨缺损，成功构建比格犬半侧下颌骨缺损的动物模型； 4．术后3月在移植同种异体骨复合干细胞组中可以检测到Y染色体特异性的基因片段，而在对照组中没有显示。说明移植的骨髓间充质干细胞在骨组织中存活并参与了新骨的形成。 5．术后1、3、6个月，对比格犬实施安乐死，每组处死3只,经大体观察及CT扫描显示单纯冻干骨，骨表面的孔未痕迹明显，成骨速度缓慢；而冻干骨与自体干细胞及同种异体干细胞组骨组织吸收明显，成骨速度较快，骨表面的孔已经愈合。组织学显示术后1、3、6月冻干骨复合自体及同种异体干细胞组的成骨速度、血管化成骨均优于单纯冻干骨组。术后6个月，4组之间微血管密度数据统计学结果：同种异体冻干骨组+自体干细胞及同种异体干细胞组微血管密度两者之间未见显著性差异（P0.05），但均比正常下颌骨组多（P0.05），而单纯同种异体冻干骨组的微血管密度明显少于其他三组（（P0.05）。术后1、3、6月抽取4组比格犬外周血，检测白细胞介素2、4、6的水平，结果显示:4组1、3、6月白细胞介素2、4、6未见无显著性差异（P0.05）。通过Micro-CT对术后6月4组骨组织进行骨密度检测，结果显示单纯的同种异体冻干骨的骨密度与其他三组相比显著降低（P0.05）。同种异体冻干骨复合自体及同种异体干细胞组两组之间没有显著性差异（P0.05）,复合干细胞的2组与正常下颌骨组的骨密度相比未见显著性差异（P0.05）。通过术前、术后下颌骨CT体积测量，比较分析4组下颌骨体积的变化情况。结果显示单纯同种异体冻干骨、同种异体冻干骨复合自体及同种异体干细胞组体积均显著减少（P0.05），单纯同种异体冻干骨、同种异体冻干骨复合自体及同种异体干细胞组三组之间体积之间无显著性差异（P0.05）。 6．同种异体冻干骨复合自体骨髓修复25例患者大段下颌骨缺损，术后复查（最长观察6年），除1例患者由于口内黏膜破溃而发生感染，经处理后愈合，移植骨局部吸收，其他所有患者颌骨愈合良好，面容恢复良好，患者满意，未出现严重并发症。 7．在个人计算机上将图像采集设备获得的数据通过多种软件与各种输出设备相结进行图像分割、定量测量、模拟手术、修复体制作、手术导航等，成功构建数字化外科平台；并运用数字化外科平台对2005年1月至2014年1月间12名患者进行颌骨缺损重建手术，术后患者的面型明显改善，伤口愈合良好，患者均满意。【结论】 1.同种异体冻干骨经物理及化学方法处理后够清除骨组织内的细胞，且能够满足大段下颌骨缺损修复的生物力学要求，是一种性能优良的体内组织工程支架材料； 2.成功构建比格犬半侧下颌骨缺损的动物模型； 3.通过Y染色体标记同种异体骨髓间充质干细胞复合同种异体冻干骨体内移植结果显示移植的干细胞参与新骨形成； 4.复合骨髓间充质干细胞的同种异体骨骨改建速度比没有加细胞的同种异体骨明显，愈合是从宿主骨向移植骨，从周围向中央，从哈佛管向四周逐渐进行爬行替代的过程。 5.以同种异体冻干下颌骨为支架复合同种异体骨髓间充质干细胞能够加速移植骨的血管化，促进新骨生成； 6.同种异体下颌骨移植修复大段下颌骨缺损经长期临床随访观察，无排异反应，面容恢复满意，逐渐成骨，愈合良好，可以作为临床修复下颌骨缺损的一种选择； 7.数字化外科平台将不同数据影像经处理后相互整合，识别不同格式的数据，将不同软件和硬件的功能结合起来发挥作用，，能够帮助术前诊断、制定治疗计划，辅助手术实施，能够缩短手术时间，为医、教、研工作提供强有力的技术支持。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R782.4

【参考文献】