基于间充质干细胞的舌鳞癌的基因治疗

发布时间：2018-04-08 10:14

本文选题：基于　切入点：间充　出处：《武汉大学》2014年博士论文

【摘要】：在口腔的肿瘤中,90%以上为口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)(Choi et al.,2008),而在口腔鳞状细胞癌中,舌鳞癌(tougue squamous cell carcinoma,TSCC)占80%。虽然口腔鳞癌的标准化治疗方法仍然在不断改进,但近十年的死亡率仍未发生改变,5年生存率在50%左右(Marsh D,2011)。近年来,学者们一直在寻求一种新的治疗策略——靶向分子治疗,即找到仅对肿瘤组织有杀伤作用而对正常组织无杀伤作用的生物制剂或细胞因子和能靶向到达肿瘤组织的载体的理想结合。TNF相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis inducing ligand, TRAIL)是TNF超家族成员之一,是一种能诱导转化细胞凋亡而对正常细胞无害的2型跨膜蛋白,已有多项研究证实了重组TRAIL蛋白的抗肿瘤活性(Ashkenazi A,1999; Ciavarella et al.,2012),是最有潜力成为肿瘤治疗的理想分子,然而因其药物半衰期短,要想达到理想的治疗效果就需要频繁大剂量的给药。因此还需要一种能将TRAIL蛋白靶向持续输送到肿瘤组织内的载体。因有研究发现骨髓来源的MSCs (bone marrow derived mesenchymal stem/stromal cells, BM-MSCs)能向肿瘤组织归巢,而使学者们想到利用MSCs作为细胞载体,通过基因修饰的方法来靶向输送TRAIL蛋白,并在恶性胶质瘤、乳腺癌以及黑色素瘤等动物模型中展示出有效的抑瘤作用(Studeny et al.,2002; Nakamura et al.,2004; Schichor C et al.,2006; Dwyer et al.,2007; Bak et al.,2011)。但与BM-MSCs相比,牙龈来源的MSCs (gingiva-derived MSCs, G-MSCs)具有不少优势,比如容易分离培养,细胞均一性好,体外培养过程中不依赖生长因子且增殖较快,多次传代后仍然保持稳定的形态和生物学性能。此外,G-MSCs长期培养后依然能保持正常的染色体组型和端粒酶活性,不表现成瘤性(Tomar et al.,2010)。 G-MSCs是否也能向肿瘤组织归巢,替代BM-MSCs而成为理想的细胞工具?本研究旨在探索G-MSCs是否具有向TSCC趋化的特性,并进一步构建稳定表达TRAIL蛋白的G-MSCs细胞载体(G-MSCFLT),即’TRAIL蛋白的靶向缓释系统,体、内外探讨G-MSCFLT抑制TSCC生长的作用。研究内容分外三大部分：第一部分 G-MSCs对舌鳞癌细胞归巢现象的体外研究目的体外研究G-MSCs向舌鳞癌细胞系的趋化能力。方法用组织块的原代细胞培养方法培养、扩增牙龈细胞,再采用Stro-1免疫磁珠筛选的方法,从牙龈细胞中分离G-MSCS。采用Transwell培养板研究G-MSCs向舌鳞癌细胞系的迁移能力。结果牙龈组织中原代培养,纯化的G-MSCs呈成纤维样细胞,具有多项分化能力(成骨,成脂)。迁移实验表明：与空白组(65.8±14.8)和阴性对照组(115.6±7.6)相比,该细胞向舌鳞癌细胞系Tca8113和Cal27迁移显著增加(Cal27:466.8±30.4; Tca8113:416.8±19.4cells/field)(P0.001, ANOVA)。结论G-MSCs能显著向舌鳞癌细胞系Tca8113和Cal27迁移。第二部分 TRAIL基因修饰的G-MSCs载体的构建目的构建能稳定表达TRAIL蛋白的G-MSCs细胞载体。方法以pLL3.7为骨架,通过酶切、连接的方法将TRAIL基因全长插入到CMV启动子和GFP之间,TRAIL基因与GFP之间通过2A列相连,构建成表达TRAIL基因的表达质粒(pLLT)。 pLLT/pMD2.G/psPAX2三质粒系统通过转染试齐(?)Lipofectamin2000TM在293FT细胞里包装成慢病毒命名为LV-pLLT; pLL3.7/pMD2.G/psPAX2三质粒系统通过转染试剂Lipofectamin2000TM在293FT细胞里包装成的慢病毒命名为LV-pLL3.7,作为阴性对照。再用LV-pLLT感染G-MSCs,通过病毒感染的方法将TRAIL基因全长整合到G-MSCs的基因组里,构建出的表达TRAIL蛋白的细胞载体即为G-MSCFLT,用LV-pLL3.7感染G-MSCs即为G-MSCFL,为空载体,作为阴性对照。通过流式检测感染效率,用免疫荧光、Western-Blot以及ELISA检测TRAIL蛋白的表达。结果通过慢病毒感染的方法将TRAIL整合进G-MSCs的基因组的效率高达88.66%±0.13%, G-MSCFLT能稳定表达TRAIL蛋白。结论通过慢病毒感染的方法能成功高效地构建稳定表达TRAIL蛋白的G-MSCs细胞载体。第三部分 TRAIL基因修饰的G-MSCs抑癌作用的体、内外实验研究目的体内、外研究TRAIL基因修饰的G-MSCs对TSCC的生长抑制作用方法将舌鳞癌细胞系(Tca8113和Cal27)与G-MSCFLT体外(1：1)直接共培养,采用凋亡染色试剂盒(Annexin V-PE/7-ADD Kit)在流式细胞仪上检测G-MSCFLT对舌鳞癌细胞系的凋亡诱导作用。Tca8113和Cal27与G-MSCFL共培养组则为阴性对照组。体内抗瘤作用以裸鼠为动物模型,选用Tca8113肿瘤细胞,通过局部(与肿瘤细胞混合注射和瘤体内注射)及系统(尾静脉注射)两种途径移植G-MSCFLT,通过瘤体的大小及TUNEL凋亡检测试剂盒检测肿瘤切片中肿瘤细胞凋亡的情况来评估其抑瘤作用。结果体外实验表明,G-MSCFLT能显著诱导舌鳞癌细胞(Tca8113和Ca127)凋亡(Tca8113:48.45%±3.56%vs.17.82%±3.03%,P0.01, ANOVA)(Cal27:52.63±16.03vs15.92±10.64,P0.01,ANOVA)。动物实验表明,在混合注射移植途径中,G-MSCFLT/G-MSCFL与舌鳞癌细胞均以5×105混合物注射时,G-MSCFLT组无瘤体形成。将G-MSCFLT与Tca8113分别以5×105与1×106混合物注射时,G-MSCFLT组有瘤体形成,但与空白组相比,肿瘤重量明显减小(85±42.72mg vs.738±430.49mg;P0.01,Kruskal-Wallis).在瘤体内注射移植途径中,G-MSCFLT组瘤体重量与G-MSCFL组相比无明显差异(124±60.66mg vs.370±217.41mg,P0.05,KruskaI-Walli),但与空白对照组相比,重量显著减小(124±60.66mg vs.738±430.49mg；P0.01,Kruskal-Wallis).在尾静脉注射系统移植途径中,G-MSCFLT组瘤体重量显著低于G-MSCFL组(45.00±23.80mg vs.125.00±51.96mg；P0.05,Kruskal-Wlallis).在瘤体的组织切片中也能检测到G-MSCFLT的存在,以及相应TRAIL蛋白的表达,并检测到TRAIL蛋白表达的部位有大量肿瘤细胞凋亡。结论G-MSCFLT能迁移到肿瘤组织内,并表达TRAIL蛋白,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤的生长。G-MSCs是携带TRAIL基因治疗舌鳞癌的有效靶向细胞载体,可用于舌鳞癌的基因治疗,并为其临床应用提供实验室依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.86

【参考文献】