LARGE和α-DG异常与舌癌转移的研究

发布时间：2018-04-14 17:42

本文选题：肌营养不良蛋白聚糖 + 样糖基转移酶　；参考：《武汉大学》2014年博士论文

【摘要】：口腔癌是世界第六大恶性肿瘤,其中在中国每年约有21000例新发病例,大约11000人死亡。舌癌是头颈部最常见的恶性肿瘤,复发和淋巴结转移是最终导致患者死亡的重要原因。如何控制淋巴结转移率和提高癌症患者的生存率则成为口腔鳞癌研究的重点。细胞与细胞外基质相互作用的丢失是恶性肿瘤转化的重要特征。DG是一种普遍存在于组织的粘附分子,通常表达于细胞膜与基底膜之间的界面,充当了细胞-细胞外基质间相互作用的“分子桥”。DG对调节基底膜形态发生、细胞骨架构建、细胞极化、细胞生长、信号传导及维持组织整合性等起着重要作用,DG在肿瘤生物学中的作用越来越受到关注。在许多上皮细胞癌中都观察到α-DG蛋白的表达缺失,提示其在癌症发生发展中起到重要作用,但是其缺失的机制仍然不清楚。在已知的七种参与α-DG翻译后糖基化修饰的糖基转移酶中,LARGE是a-DG糖基化过程和决定α-DG生物学功能的关键糖基转移酶基因。那么,舌癌中是样糖基转移酶LARGE基因是否出现了功能失活,以致于α-DG的正常糖基化过程无法启动?具体失活机制又是什么?目前尚不清楚。本研究将对这些问题进行初步探讨。实验一α-DG在舌鳞状细胞癌中的表达异常与肿瘤转移的关系目的：探讨α-DG在舌癌组织和细胞系中的表达情况,分析a-DG表达与临床病理因素的关系,研究导致其缺失的原因是发生于转录翻译的过程中、还是发生在翻译后修饰阶段。方法：应用免疫组织化学检测50例舌鳞状细胞癌组织和13例正常粘膜组织中,western blot检测舌癌细胞系(CAL27, SCC4)中α-DG的表达,RT-PCR验证舌癌细胞系中DAG1基因转录情况。结果：与正常组织相比,α-DG(VIA4-1)和α-DG(IIH6)在舌癌组织和细胞系中表达明显降低,而α-DG(6C1或F-18)表达无明显差异。α-DG(VIA4-1)和α-DG(IIH6)的表达水平与肿瘤TNM分期(N=50,P=0.005,0.013)、颈部淋巴结转移(P=0.016,0.025)明显相关,α-DG(IIH6)的表达水平还与肿瘤大小相关(P=0.016,0.025)。RT-PCR结果DGmRNA无明显改变。结论：舌癌中α-DG糖基化位点表达明显降低,且与临床病理关系密切。α-DG的缺失并不是由于基因转录或翻译过程异常,而是与翻译后糖基化修饰有关。实验二LARGE在舌鳞状细胞癌中表达及启动子区甲基化状态研究目的：探讨LARGE是否在舌癌中正常表达,检测舌癌组织级细胞中的LARGE基因是否发生了过度甲基化,分析舌癌中的α-DG糖基化异常是否与LARGE基因异常有关。方法：应用免疫组织化学检测50例舌鳞状细胞癌组织和13例正常粘膜组织中LARGE的表达,甲基化特异性PCR检测舌癌组织级细胞系中LARGE基因启动子区甲基化状态,分析LARGE表达及甲基化状态与临床病理因素的关系。RT-PCR验证舌癌细胞系中LARGE基因转录情况。结果：与正常粘膜相比,LARGE在舌癌中表达明显降低(P=0.01),基因启动子区甲基化几率明显增高(P=0.01)。细胞系中未检测到表达,且RT-PCR未检测至LARGE mRNA的转录。LARGE表达降低和启动子区过甲基化与颈部淋巴结转移(P=0.022,0.015)、TNM分期相关(P=0.000,0.043)。LARGE过甲基化与α-DG糖基化表位的表达呈明显相关。结论：在舌癌中,LARGE低表达,其基因失活,主要原因可能是由于其启动子区过度甲基化,因而导致其转录缺失,进而引起α-DG糖基化降低甚至缺失。实验三LARGE过表达及去甲基化对α-DG功能性表达的影响目的：研究体外转染过表达LARGE或去甲基化试剂物5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, Aza-dC)处理是否能恢复LARGE的表达,是否能修复α-DG的糖基化。方法：构建重组LARGE表达载体,舌癌细胞系经转染或Aza-dC处理后,RT-PCR检测LARGE和DGmRNA, western blot检测α-DG蛋白主链及糖基化表位表达情况。结果：舌癌细胞系经转染LARGE或Aza-dC处理后,LARGE和DG mRNA表达增加,α-DG主链无明显差别,a-DG (VIA4-1)和α-DG (IIH6)即糖基化表位则明显较对照组表达明显升高。结论：外源性LARGE表达载体转染和去甲基化均能使舌癌细胞中LARGE恢复表达,从而修复a-DG的糖基化。实验四LARGE过表达及启动子区去甲基化对舌鳞癌细胞功能的影响目的：研究转染外源性LARGE表达载体转染和去甲基化处理恢复的α-DG糖基化是否修复了细胞功能、α-DG与细胞外基质配体结合能力是否增强、肿瘤细胞侵袭迁移能力是否改变。方法：舌癌细胞系经转染或Aza-dC处理后,层粘连蛋白覆盖分析α-DG与细胞外基质成分laminin结合能力,细胞粘附分析肿瘤细胞与laminin粘附能力,Transwell迁移实验分析细胞的迁移能力。结果：5-dA处理和外源性LARGE过表达后,α-DG与其层粘连蛋白laminin结合能力均较对照组明显增加,癌细胞与层粘连蛋白laminin的结合能力明显增强,细胞迁移能力明显下降。结论：5-dA处理和外源性LARGE过表达能恢复LARGE的表达,修复了DG功能性糖基化,从而使肿瘤细胞与基质中层粘连蛋白laminin结合能力增强,肿瘤细胞由基底膜逃离几率减小,使肿瘤细胞的侵袭与迁徙能力减弱。以上研究结果表明,在舌鳞状细胞癌组织和细胞系中,α-DG糖基化表位降低甚至缺失,LARGE表达明显降低且其启动子区过甲基化,α-DG和LARGE的异常与舌癌临床分期和颈部淋巴结转移等病理学参数关系密切。过表达LARGE或去甲基化可修复舌癌细胞中α-DG糖基化,增强α-DG与细胞外基质Laminin亲和力,降低细胞迁移能力。研究结果提示舌癌中α-DG糖基化异常是由于糖基转移酶LARGE启动子区过度甲基化所导致。
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【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.86

【共引文献】