ClC-7影响牙发生的体内研究

发布时间：2018-04-20 01:16

  本文选题：小干扰RNA + RNA干扰　； 参考：《第四军医大学》2014年硕士论文

【摘要】：在前期课题组的临床和基础研究中，我们发现牙的发育和ClC-7分子密切相关。一方面表现在CLCN7基因突变所引起的骨硬化症患者，，可出现牙根发育不全及牙萌出受阻，部分牙有釉质发育不全等异常表现；另一方面，CLC-7蛋白在胚胎时期小鼠及出生后P1小鼠的牙胚中均有表达。所以，我们认为ClC-7在牙发育中可能起到了非常重要的作用。为验证该假说，本实验采用壳聚糖作为siRNA载体，对Clcn7-siRNA进行包裹，以保护siRNA免受核酸酶的降解及提高细胞摄取率；然后通过颌骨局部注射CS-Clcn7-siRNA纳米粒溶液的方法，使Clcn7-siRNA分布于特定牙胚及其周围组织，从而观察当牙胚局部Clcn7基因水平下降时，其牙胚发育的特征。 方法： 实验一：选取新生小鼠上颌第一磨牙为研究对象，进行Cy5.5-siRNA的CS包裹后注射，通过小动物活体成像技术，比较腹腔注射和牙胚局部注射对牙胚局部的影响，探索和确定一种研究牙胚中基因的颌骨局部注射siRNA的方法。 实验二：使用建立的颌骨局部注射法将CS-Clcn7-siRNA纳米粒溶液局部注射于牙胚周围，通过石蜡切片HE染色和Micro-CT扫描，观察注射后不同阶段牙发育的特征，包括牙胚组织的相关细胞或结构，如成釉细胞、成牙本质细胞、牙釉质和牙本质等的形成和变化规律，验证Clcn7在牙发育中的作用。 实验三：用免疫组化的方式比较对照组和实验组在CLC-7表达上的区别，判断CS-siRNA纳米粒溶液沉默Clcn7的有效性。 结果： 1.CS-siRNA纳米粒溶液腹腔注射后的荧光分布和强度：随着时间的延长，荧光在腹腔内的分布范围先扩大，后缩小；强度先增强，后减弱。牙胚处始终没有检测出荧光分布。分离的上颌骨牙胚处不能检测出荧光。 2.局部注射法的建立：首先，注射蓝色染料后，探针挖出牙胚成蓝色；其次，小动物活体成像结果显示，于左侧上颌第一磨牙牙胚处注射CS-Cy5.5-siRNA纳米粒溶液后，上颌骨牙胚处有荧光；最后，牙胚组织冰冻切片在小动物活体成像下显示牙胚处有荧光，且HE染色结果显示牙胚组织结构完好。 3.石蜡切片HE染色和Micro-CT结果显示，实验组牙胚的成釉细胞和成牙本质细胞受到影响，牙釉质、牙本质发育和牙萌出障碍，牙形态结构紊乱。 4.P4小鼠石蜡切片免疫组化染色结果显示，对照组小鼠CLC-7蛋白在牙胚内的成釉细胞阳性结果表达最强，成牙本质细胞和部分的牙乳头细胞表达其次强，星网状层上的CLC-7表达相对较弱。实验组小鼠CLC-7蛋白在牙胚内部分的牙乳头细胞、成牙本质细胞、成釉细胞和星网状层细胞内阳性表达降低或不表达。` 结论： 1.腹腔注射方法目前不能将CS-siRNA有效递送至颌骨和牙胚组织。局部注射方法具有定位性强和效应局限等特征，可用于降低小鼠上颌第一磨牙的局部基因表达。 2.局部注射CS-Clcn7-siRNA用以沉默牙胚中Clcn7基因的方法可行，此方法为研究小鼠牙胚中其他基因的作用提供了新的研究途径。 3.Clcn7基因局部沉默后可影响牙釉质和牙本质的发育、牙形态、牙根的发育和牙的萌出。 本课题通过局部注射CS-Clcn7-siRNA的方法，首次将CS-siRNA应用于颌骨局部，有效地观察了Clcn7基因在局部沉默后对牙胚发育的影响。我们认为Clcn7基因可能是通过成釉细胞和成牙本质细胞对牙釉质和牙本质的形成产生影响；通过对牙乳头形态的影响，参与调控牙形态特征；通过影响牙胚周围组织和细胞，影响牙根发育。本课题不仅通过载体包裹siRNA的方法验证了其参与牙胚发育的调控，研究了ClC-7在牙胚发育中的作用；同时本实验建立的局部注射siRNA的方法也为研究牙胚中其他基因的生物学作用提供了新的研究途径和方法。 虽然局部注射CS-Clcn7-siRNA能够有效降低牙胚局部CLC-7的表达降低，并且导致一些牙胚组织和细胞产生了形态变化，但其机制如何，有哪些分子参与调控其过程，本课题尚未给予答复，我们将在后续的研究中针对这些问题进行深入研究。
[Abstract]:In the clinical and basic research of the previous group, we found that the development of teeth is closely related to the ClC-7 molecule. On the one hand, the patients with bone sclerosis caused by CLCN7 gene mutation can appear root dysplasia and tooth eruption, and some teeth have enamel dysplasia. On the other hand, CLC-7 protein is small in the embryonic period. We think that ClC-7 may play a very important role in tooth development. In order to verify this hypothesis, we use chitosan as a siRNA carrier to wrap Clcn7-siRNA in order to protect siRNA from nuclease reduction and increase cell uptake, and then through the jaw bone Bureau. The method of injection of CS-Clcn7-siRNA nanoparticle solution is used to distribute Clcn7-siRNA in specific tooth and surrounding tissues, so as to observe the characteristics of tooth germ development when the local Clcn7 gene level of tooth germ drops.
Method锛

本文编号：1775580