IL-17诱导人牙周膜成纤维细胞表达RANKL、OPG的p38MAPK通路研究

发布时间：2018-05-26 18:38

  本文选题：白介素17 + 人牙周膜成纤维细胞　； 参考：《广西医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：实验目的:通过观察p38MAPK信号通路抑制剂(SB203580)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)表达RANKL、OPG的影响,探究p38MAPK信号通路是否参与IL-17、HPDLF介导破骨细胞分化的过程。明确IL-17诱导人牙周膜细胞促骨吸收作用的可能信号转导途径,探讨IL-17参与正畸相关炎性牙根吸收的发生机制。实验方法:1.采用组织块培养法,体外培养原代HPDLF,并进行传代纯化。取第4代细胞,采用免疫荧光细胞化学法,对所培养的细胞进行来源鉴定。MTT法分别检测0、2.5、5、10、20、40μmol/L的p38MAPK抑制剂对HPDLF增殖活性的影响。2.Western blot检测20ng/ml的IL-17刺激HPDLF(0、20、40、60、80min)后,细胞内p38MAPK磷酸化蛋白的表达情况。3.实验分为六组:A组(空白对照)、B组(DMSO)、C组(抑制剂)、D组(IL-17)、E组(IL-17+DMSO)、F组(IL-17+抑制剂)。按照分组,用10μmol/L的SB203580,20ng/ml的IL-17处理细胞。RT-PCR检测HPDLF中RANKL、OPG因子的mRNA表达水平;Western blot、ELISA检测HPDLF中RANKL、OPG因子的蛋白表达水平。实验结果:1.培养的细胞为长梭形,呈放射状生长;传代后细胞均匀分布,生长状态稳定。经鉴定该细胞为来源于间充质细胞,且非上皮来源的细胞。结合取材部位可判定细胞为HPDLF。MTT结果显示,以浓度为0-40μmol/L的SB203580分别刺激HPDLF,0-10μmol/L中,OD值随着浓度的增加持续升高,HPDLF增殖活性逐渐增强。在10μmol/L中,OD值最大,HPDLF增殖活性达到最强。10-40μmol/L中,OD值随着浓度的增加逐渐下降,HPDLF增殖活性逐渐降低。2.在20ng/ml的IL-17刺激下,磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的相对表达量随着时间的增加而增大。在60min时达最高水平,80min时开始下降。3.与空白对照组比较,IL-17刺激后RANKL的mRNA、蛋白表达量升高;OPG的mRNA表达量降低;RANKL/OPG的mRNA比值升高。加入抑制剂后,IL-17刺激RANKL的mRNA、蛋白表达量降低;OPG的m RNA表达量升高,RANKL/OPG的mRNA比值降低。IL-17调控RANKL、OPGmRNA表达的作用,被p38MAPK抑制剂阻断。实验结论:1.组织块培养法成功地建立了人牙周膜成纤维细胞系。经传代,细胞纯化,细胞生物学性状稳定。适宜浓度的SB203580对HPDLF增殖活性有促进作用,但过大浓度的SB203580抑制HPDLF增殖,其中10μmol/L为HPDLF的最适浓度。2.IL-17能激活p38MAPK蛋白,且存在时间依赖性。IL-17通过p38MAPK通路促进HPDLF中RANKL的表达,抑制OPGmRNA表达;上调RANKL/OPG的mRNA比值。
[Abstract]:Aim: to investigate the effect of p38MAPK signaling pathway inhibitor (SB203580) on the expression of RANKLL-OPG in human periodontal ligament fibroblasts (HPDLFs), and to explore whether the p38MAPK signaling pathway is involved in the process of osteoclast differentiation mediated by IL-17 HPDLF. To clarify the possible signal transduction pathway of IL-17 inducing bone resorption in human periodontal ligament cells and to explore the mechanism of IL-17 involved in orthodontic inflammatory root resorption. Experimental method: 1. Primary HPD LF was cultured in vitro and purified by tissue mass culture. In the fourth passage, the cultured cells were identified by immunofluorescence cytochemistry, and the proliferation activity of HPDLF was detected by p38MAPK inhibitor of 02.5U / 10 ~ 2040 渭 mol/L. 2. Western blot was used to detect the effect of IL-17 of 20ng/ml on the proliferation of HPDLF for 6080 min. Expression of p38MAPK phosphorylated protein in cells. The experiment was divided into six groups: group A (control group B) and group C (group C). The mRNA expression level of RANKL- OPG factor in HPDLF was detected by RT-PCR with 10 渭 mol/L SB203580 / 20ng / ml IL-17 treatment cells. The protein expression of RANKL- OPG factor in HPDLF was detected by Western-blottmeter Elisa. The result of the experiment was 1: 1. The cultured cells were long fusiform and radially grown, and the cells were evenly distributed after passage, and the growth state was stable. The cells were identified to be derived from mesenchymal cells and non-epithelial cells. In combination with the site of HPDLF.MTT, the results of HPDLF.MTT showed that the OD value of SB203580 stimulated with 0-40 渭 mol/L in 0-10 渭 mol/L increased continuously with the increase of concentration, and the proliferative activity of HPDLF increased gradually. In 10 渭 mol/L, the maximum OD value of HPDLF was the highest. 10-40 渭 mol/L. The OD value of HPDLF decreased gradually with the increase of concentration, and the proliferative activity of HPDLF decreased gradually. 2. Under the stimulation of 20ng/ml IL-17, the relative expression of phosphorylated p38 MAPK- p-p38 MAPK increased with the increase of time. It began to decrease at 80 minutes after reaching the highest level in 60min. Compared with control group, mRNAs of RANKL stimulated by IL-17 increased the mRNA expression of OPG and decreased the mRNA ratio of RANKL / OPG. After adding the inhibitor, the mRNA expression of RANKL was stimulated by IL-17. The protein expression decreased, the expression of m RNA increased and the mRNA ratio of RANKL / OPG decreased. IL-17 regulated the expression of RANKL / OPG mRNA, which was blocked by p38MAPK inhibitor. Conclusion: 1. A human periodontal ligament fibroblast cell line was successfully established by tissue mass culture. After subculture, the cells were purified and the biological properties of the cells were stable. The appropriate concentration of SB203580 promoted the proliferation of HPDLF, but too much concentration of SB203580 inhibited the proliferation of HPDLF. The optimal concentration of HPDLF was 10 渭 mol/L. 2. IL-17 could activate p38MAPK protein, and the expression of RANKL in HPDLF could be enhanced by p38MAPK pathway. Inhibition of OPGmRNA expression and up-regulation of mRNA ratio of RANKL/OPG.
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.5

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本文编号：1938455