钛表面二氧化钛纳米棒微阵列促进人牙周膜干细胞粘附、增殖及成骨分化的研究

发布时间：2018-06-24 19:05

  本文选题：表面改性 + 纳米形貌　； 参考：《山东大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的:金属钛(titanium,Ti)因具备良好的机械强度和生物相容性而在种植外科领域得到广泛应用,然而其较差的骨结合能力和种植体周围感染仍是引起种植体失败的主要诱因。近年来,众多研究者致力于Ti种植体表面改性方面的研究以改善Ti表面的生物成骨活性及抗感染能力,最终提升种植体的成功率。纳米二氧化钛(TiO_2)因其良好的生物相容性和稳定的理化性质而在生物医学领域有着广阔的应用前景,其中,在种植体表面改性领域,纳米颗粒、纳米管等多种纳米TiO_2结构亦受到广泛的关注和研究。本研究拟在Ti表面制备一种有序排列的TiO_2纳米棒微阵列(TiO_2 nanorod arrays,TNRs),研究该纳米结构对人牙周膜干细胞(human Periodontal ligament cells,hPDLSCs)粘附、增殖和成骨分化的影响,以发掘出一种全新的种植体表面改性手段。方法:以水热反应和烧结方法在纯Ti片表面制备TNRs结构,抛光的Ti试样为对照组。通过扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、透射电镜(transmission electron microscope,TEM)、X 射线衍射(X-ray diffractometer,XRD)、原子力显微镜(atomic force microscope,AFM)、接触角测量及蛋白吸附等方法观察TNRs表面形貌、晶体构造、粗糙度及亲水性质;将hPDLSCs接种至Ti和TNRs两种试样表面,通过 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色细胞核以计算试样表面吸附的细胞数量,评价hPDLSCs在两种试样表面的早期粘附能力;通过细胞活力检测试剂盒(cell-counting kit-8,CCK8)比较hPDLSCs在两种试样表面的增殖活性;通过SEM和激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)观察hPDLSCs在两种试样表面的细胞形态;经成骨诱导14 d后,通过骨架染色和聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)对细胞骨架蛋白(F-actin)进行检测;经成骨诱导7,14,21d后,通过碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)试剂盒、茜素红染色、氯化十六烷吡啶(cetylpyridinium chloride,CPC)比色法、qRT-PCR和免疫印迹试验(Western blot)评价hPDLSCs在两种试样表面的成骨分化能力。结果:SEM及TEM的结果显示,在Ti片上合成整齐有序的直径约100nm的TiO_2纳米棒;XRD结果显示,TNRs为典型的金红石晶型;AFM的结果显示,TNRs试样的表面粗糙度高于Ti试样(P0.01);接触角测量及蛋白吸附实验的结果显示TNRs试样表面的亲水性和蛋白吸附能力也优于对照组Ti(P0.05);早期粘附实验显示,接种24h后在TNRs试样表面的hPDLSCs粘附数量明显多于Ti试样(P0.05),TNRs可以促进hPDLSCs的早期粘附;CCK-8结果显示,TNRs试样上的hPDLSCs增殖能力明显优于Ti试样(P0.05),TNRs可以促进hPDLSCs的增殖能力;SEM及CLSM观察显示,TNRs试样表面的hPDLSCs较Ti表面相比,细胞骨架呈多角形,形态更为伸展;经成骨诱导14d后,TNRs试样上的hPDLSCs细胞骨架肌动蛋白F-actin的基因表达水平显著高于Ti试样(P0.05);经成骨诱导7,14,21d后,TNRs试样表面hPDLSCs的较Ti组表现出更高的ALP活性及更多的钙盐沉积、钙结节生成(P0.05),同时,成骨相关指标ALP、Runt相关转录因子 2(runt related transcription factor 2,Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在基因和蛋白水平上相较Ti组均有显著增高(P0.05)。结论:以水热反应在Ti基质表面合成的TNRs纳米结构具有良好的生物相容性,有利于hPDLSCs的粘附和增殖,对hPDLSCs的成骨分化有显著的促进作用,有望提高Ti种植体表面的成骨活性,成为一种全新的种植体改性方法。
[Abstract]:Objective: titanium (Ti) is widely used in the field of implant surgery for its good mechanical strength and biocompatibility. However, its poor bone binding ability and periimplant infection are still the main causes of implant failure. In recent years, many researchers have devoted to the study of the surface modification of Ti implants. The biological osteogenesis and anti infection ability of the good Ti surface will eventually improve the success rate of the implant. Nano titanium dioxide (TiO_2) has a broad application prospect in the biomedical field because of its good biocompatibility and stable physicochemical properties. In the field of surface modification of the implant, nano particles, nanotube and other nano TiO_2 junctions are used. This study intends to prepare an ordered array of TiO_2 nanorod microarrays (TiO_2 nanorod arrays, TNRs) on the Ti surface to study the effect of the nanostructure on the adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal membrane stem cells (human Periodontal ligament cells, hPDLSCs), in order to discover a new implant. Method of surface modification. Method: the TNRs structure was prepared on the surface of pure Ti by hydrothermal reaction and sintering. The polished Ti sample was the control group. Through scanning electron microscope (scanning electron microscope, SEM), transmission electron microscope (transmission electron microscope, TEM), X ray diffraction, atomic force microscopy CROSCOPE, AFM), contact angle measurement and protein adsorption and other methods to observe the surface morphology, crystal structure, roughness and hydrophilic properties of TNRs. HPDLSCs was inoculated to the surface of two samples of Ti and TNRs, and the number of cells adsorbed on the surface of the specimen by 4,6- two amid -2- phenyl indole (4', 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) was used to evaluate the number of cells adsorbed on the surface of the specimen and to evaluate the hPD. The early adhesion ability of LSCs on the surface of two samples; the proliferation activity of hPDLSCs on the surface of the two samples was compared by the cell viability test kit (cell-counting kit-8, CCK8); the cell morphology of the two specimen surfaces was observed by SEM and laser confocal microscopy (Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM); and 1 was induced by osteogenesis. After 4 D, cytoskeleton protein (F-actin) was detected by cytoskeleton staining and polymerase chain reaction (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR). After osteogenesis, 7,14,21d was induced by alkaline phosphatase (Alkaline phosphatase, ALP), alizarin red staining, and chlorinated sixteen alkyl pyridine. C) the osteogenic differentiation ability of hPDLSCs on the surface of two samples was evaluated by colorimetric method, qRT-PCR and Western blot. Results: the results of SEM and TEM showed that the orderly and orderly TiO_2 nanorods with a diameter of approximately 100nm were synthesized on Ti tablets; XRD results showed that TNRs was a typical rutile crystal. The results showed that the surface of the specimen was rough. The results of the contact angle measurement and protein adsorption experiment showed that the surface hydrophilicity and protein adsorption capacity of TNRs samples were also better than that of the control group Ti (P0.05). The early adhesion experiment showed that the adhesion of hPDLSCs on the surface of TNRs samples after 24h was significantly higher than that of Ti sample (P0.05), and TNRs could promote the early adhesion of the hPDLSCs. The CK-8 results showed that the proliferation ability of hPDLSCs on the TNRs sample was significantly better than that of Ti (P0.05), and TNRs could promote the proliferation of hPDLSCs. The SEM and CLSM observed that the hPDLSCs on the surface of the TNRs specimen was polygonal and more extended than the Ti surface. The gene expression level of F-actin was significantly higher than that of Ti sample (P0.05); after 7,14,21d induced by osteogenesis, the Ti group on the TNRs surface hPDLSCs showed higher ALP activity and more calcium salt deposition, calcium nodule formation (P0.05), and the osteogenic correlation index ALP, Runt related transcription factor 2, bone bridge egg White (osteopontin, OPN) at the level of gene and protein was significantly higher than that of the Ti group (P0.05). Conclusion: the TNRs nanostructures synthesized on the surface of the Ti matrix with hydrothermal reaction have good biocompatibility, which is beneficial to the adhesion and proliferation of hPDLSCs, and has a significant promoting effect on the osteogenic differentiation of hPDLSCs, and is expected to improve the formation of Ti implant surface. Bone activity has become a new method of plant modification.
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R783.6

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本文编号：2062608