Sp1作为Klf4的ceRNA调控成牙本质细胞分化

发布时间：2018-07-03 20:01

  本文选题：成牙本质细胞 + ceRNA　； 参考：《武汉大学》2016年博士论文

【摘要】：1、Sp1 mRNA作为Klf4的ceRNA促进成牙本质细胞分化研究目的：成牙本质细胞分化是一种非常独特且复杂的过程,有很多种分子机制参与调控成牙本质细胞分化,包括生长因子,转录因子,microRNA和信号通路等,这些分子相互联系形成网络并从不同层面上调节成牙本质细胞分化。CeRNA即竞争性内源RNA,它是一种来源于生物体内部的编码或非编码RNA,通过自身的microRNA反应元件和相关的microRNA结合,从而竞争性的对受共同的microRNA调控的其他靶基因调控,在细胞分化,器官形成和疾病发生中有着重要作用。本研究试图探索在成牙本质细胞分化过程中以转录因子Klf4为中心的ceRNA调控网络及其功能。研究方法：在本研究中,利用Targetscan数据库预测Klf4的MRE及其结合的miRNA,根据共享miRNA的数量来预测KLF4的候选ceRNA。将体外诱导小鼠牙乳头永生化细胞系(mDPC6T细胞)向成牙本质细胞样细胞分化作为模型。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测候选ceRNA中随机挑选的六个基因在nDPC6T细胞分化过程中的表达模式；同时利用mRNA原位杂交技术(ISH)检测目标基因Sp1与Klf4的mRNA在出生后第二天小鼠下颌切牙中的表达模式。利用siRNA转染的方法分别抑制Sp1与Klf4的表达,然后提取总RNA与总蛋白质,利用qRT-PCR与蛋白免疫印迹技术(western blot)检测Sp1与Klf4在mRNA及蛋白水平表达的变化。利用双荧光素酶报告实验检测Sp1与Klf4分别对于Klf4 3'UTR与Spl 3'UTR的作用。通过siRNA技术抑制Dicer酶的方法检测Sp1与Klf4之间的相互调控作用是否具有microRNA依赖性。通过western blot技术检测过表达共享microRNA对于Spl与Klf4的调控作用,并利用双荧光素酶报告实验验证了mir-la, mir-7a-5p, mir-135a-5p和mir-29b与Spl与Klf4确实存在结合。最后,在mDPC6T细胞中过表达Spl 3'UTR,利用qRT-PCR和碱性磷酸酶活性检测试验验证Sp1 3'UTR对成牙本质细胞分化的影响。研究结果：以Klf4为中心的候选ceRNA有30个,随机挑选的六个基因中,Spl, Qk和Tnrc6b的mRNA表达水平都显著上升,这与Klf4 mRNA的表达趋势一致。但是,Nfib,Nova1和Bc111a的mRNAb表达水平是显著下降的,与Klf4 mRNA的表达趋势相反；Spl和Klf4的mRNA在PN2小鼠的下颌切牙的成牙本质细胞层中具有非常相似的表达模式。抑制Spl的表达能够显著下调Klf4的表达水平,同样的,抑制Klf4的表达能显著下调Spl的表达水平。下调Spl的表达能够显著抑制含有Klf4 3'UTR区的双荧光素报告质粒的荧光素酶活性,下调Klf4的表达能够显著抑制Spl 3'UTR区荧光素酶活性。当Dicer的表达受到抑制时,Spl和Klf4的相互调控的microRNA依赖性消失；miR-la, miR-7a, miR-29b和miR-135a能同时与Spl和Klf4结合并能抑制Spl和Klf4的表达；Sp1 3'UTR能够上调DMP1,DSPP和ALP的mRNA表达水平,并能上调碱性磷酸酶的活性。结论：SP1 mRNA作为KLF4的ceRNA能够通过与Klf4竞争性的结合mir-1a, mir-7a-5p, mir-135a-5p和mir-29b米上调Klf4的表达,从而促进成牙本质细胞分化。2、转录因子SP1通过激活DMP1启动子的转录来促进成牙本质细胞分化研究目的：成牙本质细胞是一种神经嵴来源的呈现极化特征的终末分化的细胞。牙乳头细胞(DPCs)通常被认为是成牙本质细胞的祖细胞,他们具有分化为成牙本质细胞的潜能。转录因子是一类能够与基因启动子区特异性的结合,从而确保目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。已有多种转录因子被证实参与了成牙本质细胞的分化。SP1属于specificity protein/Kruppel-like转录因子(SP/KLF)家族。SP1在很多生理过程中发挥了很重要的作用,包括细胞的分化,凋亡以及胚胎的形成等。在不同的组织器官中,SP1在细胞分化过程中都具有很重要的作用。本研究试图探讨转录因子SP1在成牙本质细胞分化过程中的作用及其作用机制。研究方法：在本研究中,我们利用免疫组化的方法,检测PN2小鼠切牙中SP1蛋白的表达模式。我们利用了在体外诱导小鼠牙乳头细胞系(mDPC6T细胞),来模拟牙乳头原代细胞向成牙本质细胞分化的过程。mDPC6T细胞在矿化诱导液中连续培养0,1,5,7,11,14天,提取相应天数的蛋白,通过Western blot检测SP1蛋白的表达。同时,我们利用免疫组化检测了SP1蛋白在mDPC6T细胞向成牙本质细胞分化中的定位。为了探索SP1蛋白在小鼠成牙本质细胞分化中的功能,在mDPC6T细胞中过表达SP1的蛋白编码区(CDS)或者抑制SP1的表达,并通过qRT-PCR技术和蛋白免疫印迹技术来检测成牙本质细胞分化过程中标志性基因DMP1, DSPP和ALP的表达水平。我们还应用检测碱性磷酸酶活性和茜素红染色的方法来验证过表达或者抑制SP1表达对于碱性磷酸酶活性和矿化结节形成量的影响。利用双荧光素酶报告实验来验证SP1蛋白是否可激活DMP1启动子活性,通过在mDPC6T细胞中抑制SP1的表达的同时过表达DMP1来检测DMP1是否能挽救抑制SP1导致的成牙本质细胞分化受阻。研究结果：SP1蛋白在前期成牙本质细胞中没有表达,高表达于极化期的成牙本质细胞中；在分泌期的成牙本质细胞中SP1蛋白信号强度较弱；仅有极少数的成熟期的成牙本质细胞表达SP1蛋白。在mDPC6T细胞分化过程中,SP1蛋白水平在第7天出现显著上调,在第11天与第14天时,SP1的蛋白一直维持高表达水平。免疫荧光显示在第0天时,SP1蛋白表达在mDPC6T细胞的胞浆和胞核里,且在胞核表达较少；在诱导第7天时,SP1蛋白信号的亮度明显增强,且SP1蛋白主要集中在胞核中,在胞浆中也有微弱表达。过表达SP1可上调DMP1,DSPP和ALP mRNA和蛋白表达水平,并可促进矿化结节的形成；抑制SP1表达可下调DMP1, DSPP和ALP mRNA和蛋白表达水平,并可抑制矿化结节的形成。双荧光素酶报告实验发现SP1可以激活DMP1的启动子,并可促进DMP1的表达,并且过表达DMP1可在一定程度上挽救由于抑制SP1表达而引起的成牙本质细胞分化受阻现象。结论：转录因子SP1在小鼠牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中表达上调,并可以通过上调DMP 1启动子活性来促进成牙本质细胞分化。
[Abstract]:1, Sp1 mRNA as Klf4 ceRNA promotes odontoblast differentiation. The differentiation of odontoblast cells is a very unique and complex process. There are many molecular mechanisms involved in the regulation of odontoblast differentiation, including growth factors, transcription factors, microRNA and signal transduction pathways. These molecules interact with each other to form a network and form a network. Modulating the differentiation of odontoblast cells at different levels,.CeRNA, a competitive endogenous RNA, is a encoding or non coding RNA derived from the internal organism, combining its own microRNA reaction element with the associated microRNA, so as to compete for the regulation of its target gene regulated by common microRNA, in cell differentiation, organ formation and This study attempts to explore the ceRNA regulatory network and its function centered on the transcription factor Klf4 in the process of odontoblast differentiation. In this study, the Targetscan database is used to predict the MRE of Klf4 and the miRNA of its binding, and to predict the candidate ceRNA. of KLF4 based on the number of shared miRNA. In vitro induction of mouse dental papilla immortalized cell line (mDPC6T cells) to odontoid cell like cell differentiation as a model. Real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression pattern of six randomly selected genes in the candidate ceRNA in nDPC6T cell differentiation; the target gene was detected by mRNA in situ hybridization (ISH) at the same time. The expression pattern of Sp1 and Klf4 mRNA in the mandibular incisor of mice at second days after birth. The expression of Sp1 and Klf4 was inhibited by siRNA transfection, then the total RNA and total protein were extracted, and the changes in the expression of Sp1 and Klf4 were detected by qRT-PCR and protein immunoblotting (Western blot). The double luciferase reporter was used. The effect of Sp1 and Klf4 on Klf4 3'UTR and Spl 3'UTR respectively. The interaction between Sp1 and Klf4 was detected by siRNA technology to detect the mutual regulation between Sp1 and Klf4. The experiment verified that mir-la, mir-7a-5p, mir-135a-5p and mir-29b have a real combination with Spl and Klf4. Finally, the over expression of Spl 3'UTR in mDPC6T cells, and the effect of qRT-PCR and alkaline phosphatase activity test to verify the effect of Sp1 3'UTR on the differentiation of dentin cells. Of the six genes, the mRNA expression level of Spl, Qk and Tnrc6b increased significantly, which was in accordance with the expression trend of Klf4 mRNA. However, the mRNAb expression level of Nfib, Nova1 and Bc111a decreased significantly, contrary to the expression trend of Klf4 mRNA, and the expressions were very similar in the dentinal cell layer of the lower jaw incisors of the mice. The expression of inhibition of Spl can significantly downregulate the expression level of Klf4. Similarly, inhibition of the expression of Klf4 can significantly downregulate the expression level of Spl. Down regulation of Spl can significantly inhibit the luciferase activity of the double luciferase reporter plasmid containing Klf4 3'UTR region, and the down-regulation of Klf4 expression can significantly inhibit the Spl 3'UTR region fluorescein. Enzyme activity. When the expression of Dicer is inhibited, the microRNA dependence of the mutual regulation of Spl and Klf4 disappears; miR-la, miR-7a, miR-29b and miR-135a can simultaneously be combined with Spl and Klf4 and can inhibit the expression of Spl and Klf4. MRNA as the ceRNA of KLF4 can increase the expression of Klf4 by competing with Klf4, mir-1a, mir-7a-5p, mir-135a-5p and mir-29b meters, thus promoting the differentiation of odontoblast cells.2. The transcription factor SP1 activates the transcription of the DMP1 promoter to promote the development of odontoblast differentiation: the odontoblast is a neural crest. The cells of the terminal differentiation of the origin of polarization. Dental papilla cells (DPCs) are usually considered as progenitor cells of odontoblast cells, and they have the potential to differentiate into odontoblast cells. Protein molecules expressed in space. Many transcriptional factors have been confirmed to be involved in the differentiation of odontoblast cells.SP1 belongs to the specificity protein/Kruppel-like transcription factor (SP/KLF) family.SP1, which plays an important role in many physiological processes, including cell differentiation, apoptosis, and embryo formation. In different tissues SP1 plays an important role in the process of cell differentiation. This study attempts to explore the role and mechanism of the transcription factor SP1 in the process of odontoblast differentiation. In this study, we used immunohistochemical method to detect the expression pattern of SP1 protein in the incisor of PN2 mice. The mouse dental papilla cell line (mDPC6T cell) was induced to simulate the differentiation of dental papilla cells to odontoblasts..mDPC6T cells were continuously cultured for 0,1,5,7,11,14 days in the mineralized inducer, and the protein of the corresponding days was extracted, and the expression of SP1 protein was detected by Western blot. At the same time, we detected the SP1 protein by immunohistochemistry. Localization of mDPC6T cells to odontoblast differentiation. In order to explore the function of SP1 protein in mouse odontoblast differentiation, the expression of SP1 protein coding region (CDS) or inhibition of SP1 expression in mDPC6T cells, and the identification of the differentiation process of odontoblast by qRT-PCR technique and protein immunoblotting technique The expression level of sex genes DMP1, DSPP and ALP. We also tested the effects of alkaline phosphatase activity and alizarin red staining to verify the effect of overexpression or inhibition of SP1 expression on the activity of alkaline phosphatase and the formation of mineralized nodules. The double luciferase reporter assay was used to verify whether the SP1 protein could activate the activity of DMP1 promoter. Over expression of SP1 in mDPC6T cells and over expression of DMP1 to detect whether DMP1 can save the differentiation of odontoblast induced by inhibition of SP1. The results: SP1 protein is not expressed in early dentin cells, highly expressed in the dentin cells of polarization stage, and SP1 protein in the odontoblasts of the secretory phase. The signal intensity was weak; only a few mature dentin cells expressed SP1 protein. In the process of mDPC6T cell differentiation, the level of SP1 protein increased significantly on seventh days, and the protein of SP1 remained high at the eleventh and fourteenth days. The immunofluorescence showed that the SP1 protein was expressed in the cytoplasm of mDPC6T cells at the time of immunofluorescence. The expression of SP1 protein signal was obviously enhanced at seventh days, and the SP1 protein was mainly concentrated in the nucleus and weak expression in the cytoplasm. Overexpression of SP1 could increase the level of DMP1, DSPP and ALP mRNA and protein expression, and promote the formation of mineralized nodules, and reduce the expression of SP1 to reduce DMP1, DSPP. And ALP mRNA and protein expression levels, and inhibit the formation of mineralized nodules. Double luciferase reporter experiment found that SP1 activates the promoter of DMP1 and promotes the expression of DMP1, and overexpression of DMP1 can save the differentiation of dentin cells caused by inhibition of SP1 expression to a certain extent. Conclusion: transcription factor SP1 It was upregulated in odontoblast differentiation of mouse dental papilla cells and could promote odontoblast differentiation by up regulating the activity of DMP 1 promoter.
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R78

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本文编号：2094840