【摘要】：牙周炎是常见的慢性炎症性疾病，它可以导致牙周组织不可逆性的破坏，同时炎症可以刺激血管形成，破坏的牙周组织处有大量的炎性肉芽组织形成。牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）定植在牙周膜中并具有多向分化能力。有研究证实间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）的分化是受组织微环境调节的。同样牙周膜干细胞的分化也受组织微环境的调控。有报道显示，由于炎症微环境中存在大量的血管形成因子，这些因子有利于干细胞向内皮细胞分化。那么牙周炎症微环境是否促进牙周膜干细胞的内皮向分化以及调节其内皮向分化的机制还不清楚。基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是存在于牙周炎症微环境中与牙周炎发展密切相关的重要因子。SDF-1α是重要的血管形成因子，它可以诱导趋化因子受体4[chemokine(c-x-c motif) receptor4，CXCR4]阳性表达的间充质干细胞分化为内皮样细胞。促炎因子TNF-α是SDF-1α/CXCR4轴的关键调节者，TNF-α可以通过上调SDF-1α或CXCR4的表达促进SDF-1α/CXCR4轴介导的反应。在本研究中将初步观察TNF-α和SDF-1α/CXCR4轴在牙周膜干细胞内皮向分化中的作用及二者之间的调控关系。 研究目的： 初步探讨炎症微环境下牙周膜干细胞内皮向分化能力及其分子机制。 研究方法： 1.采用酶消化联合组织块法培养正常及炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞；克隆形成实验观察两种干细胞的克隆形成能力；流式细胞仪检测两种干细胞表面分子标志物的表达；成骨诱导后茜素红染色并进行定量分析比较两种干细胞的成骨分化能力。 2.Real-time PCR检测两种干细胞中SDF-1α、CXCR4表达的差异；SDF-1α诱导两种干细胞，Real-time PCR检测血管内皮相关基因CD31、vWF的表达差异；Matrigel基质胶管腔形成实验观察两种干细胞管腔形成情况，倒置显微镜下拍照，统计管腔形成数量并进行比较。 3.CCK-8法检测TNF-α对牙周膜干细胞生长的影响；Real-time PCR检测TNF-α对牙周膜干细胞SDF-1α、CXCR4表达的影响。 4.利用Real-time PCR和Western Blot比较单纯SDF-1α诱导组、TNF-α预处理后SDF-1α诱导组、TNF-α预处理后AMD3100阻断再加SDF-1α诱导组的血管内皮相关基因CD31、vWF、KDR和蛋白vWF、VE-cadherin的表达情况；Matrigel基质胶管腔形成实验观察TNF-α预处理后SDF-1α诱导组和TNF-α预处理后AMD3100阻断再加SDF-1α诱导组的管腔形成情况。 研究结果： 1.原代培养的两种牙周膜干细胞细胞形态为长梭形并呈漩涡状或放射状排列，具有间充质干细胞的形态特征及克隆形成能力；流式细胞仪结果显示两种干细胞均阳性表达CD105、CD90、CD29、CD146，阴性表达CD34、CD45、CD31；茜素红染色显示经诱导后的两种干细胞均可见矿化结节形成，定量分析结果显示炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞成骨能力较弱。 2.Real-time PCR结果显示炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞低表达SDF-1α、高表达CXCR4；两种干细胞经SDF-1α诱导后，，血管内皮相关基因CD31、vWF表达水平和管腔形成能力均明显高于未经SDF-1α诱导的对照组，两种细胞间相比，经SDF-1α诱导后的炎症牙周组织来源的牙周膜干细胞中的CD31mRNA、vWF mRNA的表达水平和管腔形成能力均明显高于正常牙周组织来源的牙周膜干细胞。 3.CCK-8法结果显示1ng/mL TNF-α和10ng/mL TNF-α对牙周膜干细胞生长无明显影响，100ng/mL TNF-α明显抑制牙周膜干细胞的生长；Real-time PCR结果显示10ng/mL TNF-α抑制牙周膜干细胞表达SDF-1α，促进牙周膜干细胞表达CXCR4。 4.Real-time PCR和Western Blot显示牙周膜干细胞经TNF-α预处理后加SDF-1α诱导组其血管内皮相关基因和蛋白表达水平均明显高于单纯SDF-1α诱导组；同时经TNF-α预处理后加入CXCR4抑制剂AMD3100再加SDF-1α诱导的实验组，血管内皮相关基因和蛋白表达水平以及管腔形成能力均明显降低。 结论: 炎症微环境可以促进牙周膜干细胞的内皮向分化能力，其分子机制为TNF-α通过上调牙周膜干细胞表达CXCR4，使其对环境中的SDF-1α更加敏感，从而使牙周膜干细胞的内皮向分化能力增强。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R781.42
【共引文献】
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2274613
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