过表达KLF4对小鼠成骨细胞成骨分化的影响

发布时间：2018-11-02 16:31

【摘要】：目的探讨重组腺病毒介导的肠富集Krüppel样因子(Krüppel like factor 4,KLF4)基因转染后对小鼠成骨细胞成骨分化的影响。方法采用酶消化法分离培养小鼠原代成骨细胞,经成骨诱导培养21 d后行茜素红染色。利用pHBAd-EF1-MCS-GFP系统构建携有KLF4的重组腺病毒载体(Ad-KLF4)。不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)Ad-KLF4转染成骨细胞后流式细胞仪检测转染效率。将成骨细胞随机分为对照组(未转染组)、KLF4组(Ad-KLF4转染)和GFP组(Ad-GFP转染)。Western blot检测小鼠成骨细胞中KLF4蛋白的表达;MTT检测细胞增殖;Real-time PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、核心蛋白结合因子2(runt-related transcription factor 2,RUNX2)的表达。结果倒置显微镜下可见成骨细胞呈多边形、立方形等,茜素红染色示大量红色钙化结节的形成。经酶切鉴定、基因测序成功构建携带KLF4基因的重组腺病毒载体(Ad-KLF4)。成骨细胞经最佳MOI(100 PFU/m L)处理后,与对照组及GFP组比较,KLF4组可检测到KLF4蛋白及mRNA水平显著上升(P0.01);成骨细胞增殖明显上升(P0.05,P0.01);成骨分化相关基因ALP、RUNX2、BSP的表达显著下降(P0.05,P0.01)。结论腺病毒介导的KLF4基因转染成骨细胞后可促进成骨细胞增殖,抑制其成骨分化,从而抑制骨形成。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of recombinant adenovirus mediated Kr 眉 ppel like factor (Kr 眉 ppel like factor 4 KLF4) gene transfection on osteogenic differentiation of mouse osteoblasts. Methods the primary osteoblasts of mice were isolated and cultured by enzyme digestion. After 21 days of osteogenic induction, alizarin red staining was used. The recombinant adenovirus vector (Ad-KLF4) carrying KLF4 was constructed by using pHBAd-EF1-MCS-GFP system. The transfection efficiency was detected by flow cytometry after transfection of osteoblasts with different complex (multiplicity of infection,MOI) Ad-KLF4. Osteoblasts were randomly divided into control group (untransfected group), KLF4 group (Ad-KLF4 transfected) and GFP group (Ad-GFP transfected). Western blot) to detect the expression of KLF4 protein in osteoblasts, MTT to detect cell proliferation. The expression of osteoblast associated gene alkaline phosphatase (alkaline phosphatase,ALP), bone sialoprotein (bone sialoprotein,BSP) and core protein binding factor 2 (runt-related transcription factor 2) were detected by Real-time PCR. Results under inverted microscope, osteoblasts were polygonal and square. Alizarin red staining showed the formation of a large number of red calcified nodules. The recombinant adenovirus vector carrying KLF4 gene (Ad-KLF4) was successfully constructed by restriction enzyme digestion. After being treated with the best MOI (100 PFU/m L), the levels of KLF4 protein and mRNA in KLF4 group were significantly higher than those in control group and GFP group (P0.01), and the proliferation of osteoblasts was significantly increased (P0.05, P0.01). The expression of osteoblast differentiation related gene ALP,RUNX2,BSP was significantly decreased (P 0.05 P 0.01). Conclusion Adenovirus-mediated KLF4 gene transfection into osteoblasts can promote osteoblast proliferation, inhibit osteogenic differentiation and inhibit bone formation.
【作者单位】： 第三军医大学大坪医院野战外科研究所口腔科;第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;重庆医科大学附属儿童医院重症医学科儿童发育疾病研究教育部重点实验室;
【基金】：创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室自主研究课题(SKLZZ201507)~~
【分类号】：R781

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