下调ILK表达对人舌癌细胞的转移和EMT转化的影响及其作用机制

发布时间：2018-11-19 21:59

【摘要】：目的利用RNAi技术对整合素转接激酶（integrin-linked kinase，ILK）基因表达进行特异性沉默，观察并检测ILK siRNA对体内和体外人舌鳞癌细胞的形态，生长，凋亡，侵袭和转移的等的影响，，并对沉默ILK基因表达后EMT信号通路的调控分子机制进行探讨。方法将特异性ILK siRNA表达载体及无同源性的对照载体，在脂质体介导下分别稳定转染两种人舌鳞癌TCA8113细胞及Tb细胞，分为TCA8113组、TCA8113vector组、TCA8113siILK组，Tb组、Tbvector组、Tb siILK组，通过G418筛选获得稳定表达ILK siRNA的细胞后，使用western blot及免疫荧光方法检测ILK的表达；构建裸鼠移植瘤模型；用MTT法检测细胞的增殖能力；以划痕试验检测细胞的运动迁移能力；以Transwell法检测细胞的侵袭能力；使用流式细胞仪来分析细胞周期及凋亡情况；用western blot及免疫荧光方法分析在体外及体内实验中ILK下游底物分子Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β的表达；用western blot检测与细胞粘附相关的MMP2、MMP9和EMT相关的N-cadherin、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist等的表达；光学显微镜下观察移植瘤组织切片微血管密度的变化；以CD31抗体进行免疫荧光染色观察移植瘤组织切片微血管密度的变化；光学显微镜下观察动物模型肺组织切片自发性转移瘤的情况；免疫组织化学检测移植瘤组织中ILK、MMP2、MMP9、N-cadherin、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表达；HE染色及免疫组织化学检测人舌鳞癌临床标本中ILK、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表达。结果经G418筛选获得稳定表达细胞株后，通过Western Blot及免疫荧光检测证实实验组细胞的ILK蛋白表达被沉默。形态学观察发现TCA8113siILK/Tb siILK组细胞较TCA8113/Tb组和TCA8113vector/Tb vector组细胞的上皮形态特征更为明显，细胞核较小，分裂相减少，胞浆嗜碱性较弱，表明其恶性程度较低。MTT结果提示TCA8113siILK/Tb siILK组细胞较TCA8113/Tb组和TCA8113vector/Tb vector组细胞的生长能力显著降低。划痕试验结果显示TCA8113siILK/Tb siILK组细胞较TCA8113/Tb组和TCA8113vector/Tb vector组细胞的迁移能力明显下降。Transwell实验显示TCA8113siILK/Tb siILK组细胞较TCA8113/Tb组和TCA8113vector/Tb vector组细胞的侵袭能力明显减弱。流式细胞仪分析结果发现TCA8113siILK/Tb siILK组细胞较TCA8113/Tb组和TCA8113vector/Tb vector组细胞的细胞周期发生G2-M期和G0-G1期阻滞，但细胞凋亡没有发生明显的变化。免疫荧光结果发现，TCA8113siILK/TbsiILK组细胞较TCA8113/Tb组和TCA8113vector/Tb vector组细胞中ILK、p-Akt和p-GSK3β的表达明显减少，而Akt和GSK3β的表达则没有明显变化，Western Blot显示， TCA8113siILK/Tb siILK组细胞中MMP2、MMP9、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist的表达与对照组相比显著减少（P0.05），E-cadherin的表达显著增加（P0.05）。动物移植瘤模型发现，实验组裸鼠的瘤重与对照组相比显著降低（P0.05），瘤组织中的血管密度明显减小，同时瘤组织中ILK、MMP2、MMP9、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表达表达呈弱阳性或阴性表达， E-cadherin呈强阳性表达。实验组裸鼠肺中未发现自发性转移瘤，而对照组肺中均发现自发性转移瘤。对人舌鳞癌临床标本的免疫组化检查结果，与动物实验的发现相一致。结论成功地在两种人舌鳞癌细胞中转染ILK siRNA表达质粒，并经G418筛选获得稳定表达的细胞，沉默ILK基因的表达抑制其下游底物分子Akt和GSK3β的磷酸化，并抑制与转移相关蛋白MMP2和MMP9以及与EMT相关蛋白如N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist等的表达，抑制人舌鳞癌TCA8113/Tb细胞的迁移和侵袭及转移能力，并使细胞发生G2-M期和G0-G1期阻滞从而抑制细胞的生长。动物实验证实沉默ILK基因后能够有效的抑制人舌鳞癌TCA8113/Tb细胞在体内的生长和转移的能力，其机制可能与沉默ILK基因后抑制了与EMT相关蛋白表达及通过ILK/Akt/GSK3β/Snail通路有关。故ILK可作为治疗人舌鳞癌的靶蛋白。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.85

【参考文献】