Id1和NF-κB亚单位p65在口腔鳞状细胞癌发病机制中的协同作用研究

发布时间：2018-12-13 15:31

【摘要】：目的:口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤之一,发病率高,严重威胁人类健康。目前有关OSCC的发病机制尚不清楚;有研究表明分化抑制因子-1(Id1)和核转录因子kappa B(NF-κB)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中均高表达,本研究为探讨Id1和NF-κB亚单位P65在OSCC发病机制中是否起着协同作用。方法:1.收集新鲜的OSCC临床标本和对应的癌旁组织标本。2.常规方法分离和提取鳞癌细胞,原代细胞培养、传代。3.RT-PCR与Western blot检测OSCC细胞中CD133与BMI-1的m RNA及其蛋白的表达情况。4.用FACS流式细胞仪和MACS细胞仪来分选出CD133+BMI-1+细胞并进行培养。5.构建Id1和P65基因的载体。6.用高效电转染办法分别将Id1和P65载体(单独或同时)转染CA9-22与HOK16B细胞株细胞,并检测其转染后细胞中CD133、BMI-1的表达变化。7.分别将CD133+BMI-1+细胞的CA9-22、HOK16B及OSCC细胞按不同的细胞数分别接种到SCID小鼠,观察异种移植瘤的生长情况。结果:1.在OSCC原代培养的细胞中表达CD133和BMI-1 m RNA及其蛋白,并可见到OSCC单个细胞同时表达CD133和BMI-1;2.成功分选出CD133和BMI-1双阳性的原代OSCC细胞;3.成功构建了Id1和P65基因载体;4.在培养的CA9-22细胞中,单独转染Id1或p65后,无法检测到BMI-1蛋白的表达;如同时转染Id1和p65后,可检测到细胞中CD133、Bmi-1、Cdc2与CD1.的表达明显上调,而这种协同性上调表达可被CD1抑制剂arginine vasopressin、Cdc2抑制剂catharidic aci以及蛋白抑制剂Cycloheximide所阻断;在空载体转染的细胞中无法检测到Bmi-1,、Cdc2与CD1的表达;但当转染Id1,p65,或Id1+p65后,细胞均明显表达CD1335.CA9-22细胞转染Id1和p65后,明显影响细胞周期的进程,促进细胞增殖;6.在分别接种10,000个和100,000个CD133和BMI-1双阳性细胞(来自CA9-22、HOK16B及OSCC提取的细胞)的SCID裸鼠组中,CD133和BMI-1双阳性癌细胞能引发异种移植瘤的生长。结论:1.OSCC新鲜标本中含有CD133和BMI-1双阳性细胞亚群。2.Id1和NF-κB亚单位p65可能通过Cyclin D1和Cdc2信号通路,上调CA9-22细胞中的CD133与BMI-1表达,促进了细胞的增殖。3.CD133和BMI-1双阳性细胞可以启动异种移植瘤的生长。4.Id1和NF-κB亚单位p65在OSCC发病中可能起着一定的协同作用。
[Abstract]:Objective: oral squamous cell carcinoma (Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC) is one of the most common malignant tumors in head and neck. At present, the pathogenesis of OSCC is not clear. It has been shown that both differentiation suppressor 1 (Id1) and nuclear transcription factor kappa B (NF- 魏 B are highly expressed in oral squamous cell carcinoma (OSCC) (OSCC). This study was designed to investigate whether Id1 and NF- 魏 B subunit p65 play a synergistic role in the pathogenesis of OSCC. Methods: 1. Collect fresh OSCC clinical specimens and corresponding paracancerous tissues. 2. Squamous cell carcinoma cells were isolated and extracted by routine method. The primary cells were cultured. The expression of m RNA and its protein of CD133 and BMI-1 in OSCC cells was detected by 3.RT-PCR and Western blot. 4. CD133 BMI-1 cells were isolated and cultured by FACS flow cytometry and MACS cell analyzer. Construction of Id1 and p65 gene vector. Id1 and p65 vectors were transfected into CA9-22 and HOK16B cells by high efficiency electrotransfection, respectively. The expression of CD133,BMI-1 was detected after transfection. 7. The CA9-22,HOK16B and OSCC cells of CD133 BMI-1 cells were inoculated into SCID mice according to different cell numbers to observe the growth of xenografts. Results: 1. CD133 and BMI-1 m RNA and their proteins were expressed in OSCC primary cultured cells, and OSCC cells expressed CD133 and BMI-1;2. at the same time. The primary OSCC cells which were both positive for CD133 and BMI-1 were successfully selected. Id1 and p65 gene vectors were constructed successfully. In cultured CA9-22 cells, the expression of BMI-1 protein could not be detected after transfection of Id1 or p65 alone, and CD133,Bmi-1,Cdc2 and CD1. could be detected after transfection of Id1 and p65 at the same time. The expression of Bmi-1,,Cdc2 and CD1 could not be detected in empty vector transfected cells, but the expression of Bmi-1,,Cdc2 and CD1 could be blocked by arginine vasopressin,Cdc2 inhibitor catharidic aci and protein inhibitor Cycloheximide, and the expression of Bmi-1,,Cdc2 and CD1 could not be detected in empty vector transfected cells. However, after transfection of Id1,p65, or Id1 p65, the cells expressed CD1335.CA9-22 cells transfected with Id1 and p65, which significantly affected the progress of cell cycle and promoted cell proliferation. 6. In SCID nude mice inoculated with 10 000 and 100000 CD133 and BMI-1 double positive cells (from cells extracted from CA9-22,HOK16B and OSCC) CD133 and BMI-1 double positive cells could induce the growth of xenografts. Conclusion: there are double positive subsets of CD133 and BMI-1 in fresh 1.OSCC. 2.Id1 and NF- 魏 B subunit p65 may up-regulate the expression of CD133 and BMI-1 in CA9-22 cells through Cyclin D1 and Cdc2 signaling pathway. 3.CD133 and BMI-1 double positive cells could initiate the growth of xenografts. 4.Id1 and NF- 魏 B subunit p65 might play a synergistic role in the pathogenesis of OSCC.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.85

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本文编号：2376773