纯钛表面碱处理对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响

发布时间：2018-12-16 00:16

【摘要】：自从Branemark提出骨整合这一概念以来，钛种植体作为缺牙修复的治疗手段，显著提高了患者的生存质量。种植体骨结合是种植体成功行使功能的重要影响因素[1,2]。种植体表面的理化性能在种植体骨结合中起到重要作用[3-6]，从组织学和细胞水平探讨种植体与骨结合过程已成为关注的热点。现阶段的研究表明：纯钛表面形貌[7-9]、粗糙度[10-12]、亲水性[13-17]及理化特性均对细胞的增殖和分化产生重要影响，进而影响种植体的骨整合[8,18]。骨髓间充质干细胞（BMMSCs）具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，已被广泛应用于生物医学工程领域。许多研究者都将骨髓间充质干细胞作为骨修复的成骨分化来源细胞[19,20]。本研究用梯度浓度NaOH溶液对纯钛试件进行碱处理，观察不同浓度NaOH溶液处理对纯钛试件表面纳米结构及骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。将制备的纯钛试件打磨至2000目。随机分为实验组和对照组，实验组进行梯度浓度（2.5M，5M，7.5M，10M，12.5M）NaOH溶液处理。用扫描电子显微镜(SEM)、扫描探针显微镜(SPM)对改性后实验组的表面形态观察分析,能量色散X射线光谱仪(EDX)分析表面元素组成及各元素所占比例。用体外骨髓间充质干细胞培养的方法观察碱处理后纯钛试件不同表面对细胞黏附、增殖、细胞形态、碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞外基质（EMC）矿物质沉积的影响，用酶联免疫吸附反应分析(ELISA)测定骨钙素(OCN)的产出量，用RT-PCR方法检测了不同表面骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达。结果如下： 1.碱处理后的各实验组纯钛试件表面均形成了形貌相似的多孔纳米网状结构。高倍SEM图像显示不同浓度NaOH溶液处理后纯钛试件表面的形貌细节，此相似的纳米网状结构的大小从2.5M组到10M组逐渐减小，在最高浓度12.5M组已不能形成均匀的纳米网状结构。AFM检测的表面粗糙度（Ra）也呈现出相似的趋势，从2.5M组到10M组逐渐减小，但12.5M组较10M组略有增大。接触角随着碱处理浓度的升高由40°降到6°，但在12.5M组略有升高。碱处理后试件经X线能谱（EDX）检测分析，结果显示其表面主要成分为Ti元素及微量的Na和Si元素。各实验组间Na元素含量无明显差异。 2.试件蛋白吸收检测，发现实验组的蛋白吸收明显优于对照组，且随着碱溶液浓度的增加而增加，10M组达到顶峰，12.5M组略有下降。 3.细胞培养实验发现骨髓间充质干细胞在实验组试件表面在30min、1h和3h的早期黏附明显高于对照组试件表面。细胞在实验组试件表面的早期增殖也明显高于对照组试件表面，且细胞在10M组的增殖能力最强。 4.细胞短期培养30min、1h、3h后，细胞形态呈相似的纺锤体状，但伪足的伸展表现出显著的差异。实验组试件表面培养细胞伪足的数量和长度随碱处理浓度的增加而增加，10M处理组试件表面培养细胞伪足数量及伸展长度表现最好。细胞经过3d的培养后，实验组和对照组试样表面培养细胞的形态已发生改变。对照组的细胞还保持着纺锤体形态，且板状伪足的数量也较少。实验组的细胞已经铺展，且伸展出较多的板状伪足。 5.1w和2w的ALP染色及ALP活性的实验结果显示，对照组和实验组有显著差异。3w和4w的茜素红染色，细胞外基质矿物质沉淀以及酶联免疫吸附反应分析(ELISA)测定骨钙素(OCN)的产出量，，对照组和实验组间也表现出显著差异。 6.3d和7d的RT-PCR结果发现实验组表面骨髓间充质干细胞的骨涎蛋白(BSP)、骨结合素(ON)、2型转录相关因子(RUNX2)、I型胶原(Co1-I)的表达均较对照组均显著提高。结论：纯钛试件表面经碱（NaOH）处理后形成纳米网状结构，此结构的大小、表面粗糙度、湿润性及蛋白吸附能力均与碱处理浓度的浓度有关。此纳米网状结构显著地影响了骨髓间充质干细胞的生物学行为如：黏附、增殖、ALP活性、细胞外基质矿物质沉淀、骨钙素(OCN)的产出量以及成骨相关基因的表达。这些指标均在NaOH浓度达到10M时升到峰值。本研究结果为下一步的动物实验提供实验依据，并为以后的临床应用提供理论支持。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R783.6

【共引文献】