异位再生组织中牙源性干细胞的生物学性能研究

发布时间：2019-03-09 15:30

【摘要】：干细胞是一类可以自我更新、可以分化成特定类型的功能细胞。根据来源的不同，干细胞一般分为胚胎干细胞（embryonic stem cells）和成体干细胞（adult stemcells）。胚胎干细胞可以分化为体内所有类型的细胞，而成体干细胞可以分化为相应器官的所有类型的细胞（如造血干细胞可以分化为造血系统所有类型的细胞）。再生医学就是将干细胞先分化为特定类型的功能细胞（如心肌细胞、胰岛细胞、神经细胞等），再将这些细胞移植到病人体内，替代损伤的组织，这种细胞治疗不是简单的用健康的细胞替代损伤的组织，而是使细胞移植后继续增殖分化行使功能从根本上治愈疾病。干细胞研究和再生医学给治疗退行性疾病、不可逆性疾病带来全新的手段和希望，引起各国政府的重视和大众的关注，在全球掀起干细胞研究及应用的热潮，干细胞治疗必将成为未来医学的主流。近年来，从儿童和成人的牙齿相关组织如牙龈、牙周膜、龈乳头、滤泡和牙髓中均发现了干细胞[1-6]。这些干细胞来源于外胚间充质，与骨髓间充质来源的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有类似的生物学特性如表达Stro-1、CD146、CD105等表面标记，能够分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞等特性。不仅如此，牙源性干细胞来源广泛，可以从医疗废弃物中获得，如阻生牙、正畸需要拔除的牙等，因此它们具有更为广阔的应用前景[7]。牙髓干细胞（Dental pulp stem cells，DPSCs）和牙周膜干细胞（Periodontalligament stem cells，PDLSCs）均源于外胚间充质，由神经脊细胞发育而来[8]。是研究较早、研究较多的两种牙源性干细胞，不仅体外可以被诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经源性细胞等[9]，在体内实验中，这些分化潜能也可以得到不同程度的表达[10,11]。值得注意的是将DPSCs和PDLSCs分别与羟磷灰石-磷酸三钙复合植入裸鼠体内后，分别形成了牙髓-牙本质样结构[3]和类牙周膜样组织[4]。许多大动物实验结果也表明DPSCs和PDLSCs是再生牙髓组织和牙周组织最有前景的细胞，并且已有将牙髓干细胞[12]和牙周膜干细胞[13]运用于临床治疗的报道，但其长期疗效还有待进一步研究。值得思考的是，实验证明将牙髓干细胞和牙周膜干细胞移植入体内后细胞依然长期存在自我更新和多向分化的潜能[14,15]。例如，牙髓干细胞在一定条件下可被诱导生成类间充质样细胞[16]，将诱导后的细胞植入免疫缺陷小鼠体内可以分化生成类牙髓样组织结构，证实诱导后细胞依然具有分化再生潜能。还有学者将羊的牙周膜干细胞在移植入免疫缺陷小鼠体内，8周后，移植细胞依然存在活性；虽然与原牙周膜干细胞相比移植后的细胞的自我增殖和多向分化能力有所降低，但其依然可以在体内诱导分化形成纤维样结构和血管样结构[14]。尽管已有实验在一定程度上表明牙源性干细胞在体内再生时可以保持一定的的稳定性，但是目前没有明确的实验对比分析牙髓干细胞和牙周膜干细胞体内再生时干性的保持能力，也没有研究评价过两种干细胞再生前后所具有的生物学特性发生的变化。本研究中，我们通过牙髓干细胞和牙周膜干细胞的异位再生实验，成功获取了具有代表性的再生后牙髓样细胞（Re-isolated cells from regenerated dental pulp-like tissues，re-DPCs）和再生后牙周膜样细胞（Re-isolated cells from regenerated periodontal ligament-like tissues，re-PDLCs），从细胞水平和分子水平评价DPSCs与re-DPCs，PDLSCs与re-PDLCs的细胞生物学特性的差异以及干性保持的稳定性，结合已经发表的实验研究，进一步探索干细胞应用于临床再生治疗的可行性。目的：利用DPSCs和PDLSCs进行异位牙髓牙周组织再生，鉴定再分离的细胞是否仍然具有自我更新及多向分化潜能等干细胞的特性，并比较再生后组织中细胞与DPSCs、PDLSCs生物学特性的差异，从而判定DPSCs和PDLSCs在再生过程中能否保持干细胞稳定性，为干细胞的的临床转化应用提供依据。方法： 1. DPSCs和PDLSCs的分离、培养和鉴定：采用组织块培养法分别培养牙髓细胞和牙周膜细胞；通过有限稀释法分离、纯化得到牙髓干细胞和牙周膜干细胞；流式细胞仪检测分离纯化后两种细胞的干细胞表面标记物。 2. DPSCs和PDLSCs牙本质复合物的制备、异位移植及再生后组织免疫原性鉴定：诱导DPSCs和PDLSCs形成细胞膜片，，分别与预处理过的牙本质管/牙本质柱复合成DPSCs牙本质管复合体/PDLSCs牙本质柱复合体，植入免疫缺陷小鼠背部皮下，60天后取材，从再生组织中分离培养细胞，分离培养出的细胞进行免疫荧光检测，鉴定其来源；流式细胞仪检测分离纯化后两种细胞的干细胞表面标记物。 3. DPSCs和PDLSCs再生前后生物学性能比较：通过噻唑蓝比色法、成纤维细胞集落形成单位检测DPSCs和re-DPCs以及PDLSCs和re-PDLCs的自我更新能力；成骨、成脂、成软骨诱导分化实验检测、对比分析牙髓干细胞与再生后牙髓样细胞、牙周膜干细胞与再生后牙周膜样细胞的多向分化潜能。 4.统计学分析：本实验采用均数±标准差的形式统计结果。使用t检验对两组间的差异进行比较，使用单因素方差分析分析多组之间的差异，取α=0.05。所有的数据均采用SPSS17.0软件进行统计学分析。结果： 1.成功分离培养DPSCs和PDLSCs，显微镜下观察两种细胞均呈梭形，集落样生长；流式细胞仪检测结果显示两种细胞均阳性表达干细胞表面标记物STRO-1、CD146、CD29、CD90和CD105，阴性表达造血干细胞表面标记物CD34和CD45。 2.分离、培养所得再生组织细胞，免疫荧光检测人细胞膜表面线粒体抗体，证明实验所得再生组织细胞为植入的人来源的细胞；波形蛋白抗体染色，证明所得细胞为间充质干细胞分化而来。纯化所得再生组织细胞，命名为：再生后牙髓样细胞（re-DPCs）和再生后牙周膜样细胞（re-PDLCs）；流式细胞仪检测分离纯化后的re-DPCs阳性表达干细胞标记： STRO-1（4.0%）、CD146（19.7%）、CD105（78.5%）、CD29（85.3%）、CD90（99.7%）；阴性表达造血干细胞标记CD34（2.0%）和CD45（1.6%）；以上结果与间充质来源的干细胞所具有的特征相一致；re-PDLCs中只有CD90（52.3%）呈阳性表达，而阴性表达STRO-1（2.7%）、CD146（4.6%）、CD105（11.8%）、CD29（17.4%）；阴性表达造血干细胞标记CD34（1.9%）和CD45（0.8%）。再生后牙髓样细胞和再生后牙周膜样细胞的干细胞表面标记表达均低于原牙髓干细胞和牙周膜干细胞，且re-PDLCs表达更低。 3.牙髓干细胞与再生后牙髓样细胞、牙周膜干细胞与再生后牙周膜样细胞的生长曲线和克隆形成率比较：DPSCs的增殖能力强于re-DPCs，其中DPSCs克隆形成率为24.3±1.2%，re-DPCs克隆形成率为23.8±1.3%，有统计学差异（P0.05）。PDLSCs再生前后的生长曲线和克隆形成率进行比较，PDLSCs的增殖能力明显强于re-PDLCs，其中PDLSCs克隆形成率为20.6±1.4%，re-DPCs克隆形成率为0%（P0.05）。 4.多向分化潜能 4.1牙髓干细胞与再生后牙髓样细胞、牙周膜干细胞与再生后牙周膜样细胞体外诱导成骨能力比较及成骨相关基因表达检测：成骨诱导8天ALP染色，碱性磷酸酶（AKP）定量测试分析示：DPSCs的ALP活性强于re-DPCs（P0.05）；成骨诱导4周后，茜素红染色，十六烷基吡啶定量分析显示，DPSCs成骨能力略强于re-DPCs，但无统计学意义（P0.05）；RT-PCR及Western Blot检测成骨相关基因ALP， COL-I及RUNX2显示：DPSCs成骨能力强于re-DPCs，有统计学差异（P0.05），而BSP及OCN基因的表达则无明显差异，无统计学意义（P0.05）。同样检测PDLSCs及re-PDLCs显示： re-PDLCs的ALP活性明显低于PDLSCs（P0.001），且成骨能力亦明显低于PDLSCs （P0.001）；RT-PCR及Western Blot检测成骨相关基因ALP、BSP、 OCN、 COL-I和RUNX2显示： PDLSCs成骨能力强于re-PDLCs，有统计学差异（P0.05）。 4.2牙髓干细胞与再生后牙髓样细胞、牙周膜干细胞与再生后牙周膜样细胞体外诱导成脂能力比较及成脂相关基因表达检测：成脂分化诱导21天后油红O染色，脂滴形成面积计算显示：DPSCs成脂诱导分化能力略强于re-DPCs，但两者无统计学意义（P0.05），RT-PCR及Western Blot检测成脂相关基因PPARγ也显示DPSCs的成脂诱导分化能力略强于re-DPCs，但两者无统计学意义（P0.05）。同样方法检测PDLSCs和re-PDLCs诱导成脂分化能力显示： PDLSCs诱导成脂分化能力略强于re-PDLCs，但两者亦无统计学意义（P0.05）。 4.3牙髓干细胞与再生后牙髓样细胞、牙周膜干细胞与再生后牙周膜样细胞体外诱导成软骨分化能力比较及成软骨分化相关基因表达检测：成软骨分化诱导8周，HE染色显示：DPSCs成软骨分化能力强于re-DPCs （P0.05）；RT-PCR及WesternBlot检测成软骨分化相关基因COL-II和ACAN显示，DPSCs成软骨分化能力强于re-DPCs（P0.05）。同样检测PDLSCs和re-PDLCs显示：PDLSCs成软骨分化能力明显强于re-PDLCs （P0.001）。结论： 1：牙髓干细胞、牙周膜干细胞具有成脂、成骨及成软骨诱导分化能力，且可以异位再生出类牙髓样组织和类牙周膜样组织。 2：从再生出的组织中分离出的re-DPCs和re-PDLCs分别与再生前DPSCs和PDLSCs比较发现：re-DPCs和re-PDLCs体外仍具有一定的自我增殖能力和多向分化分化潜能，表明两种干细胞异位再生后仍然维持着一定的干细胞特性。 3：细胞移植促进组织再生后，其中仍然存在着具有间充质干细胞特性的细胞，尤其是在再生后牙髓样组织中，这意味着异位再生过程中DPSCs保持的自我更新和分化能力较PDLSCs强。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R78

【参考文献】