RNAi沉默PRL-1基因对舌癌细胞生长侵袭的影响

发布时间：2019-06-21 21:35

【摘要】：研究目的： 1.针对PRL-1基因，，构建PRL-1基因重组慢病毒载体，筛选稳定感染siRNA-PRL-1慢病毒及空载病毒的人舌鳞癌Tca8113细胞株。 2.探讨siRNA-PRL-1重组慢病毒感染人舌鳞癌TCA8113细胞后，对细胞增殖、侵袭的影响并探讨其可能的机制。 研究方法： 1.按照Gene bank中PRL-1的mRNA序列(NM_003463),针对该序列设计合成5对PRL-1基因的siRNA的寡核苷酸序列，BLAST分析所设计序列的特异性。将PRL-1基因特异性siRNA序列构建至慢病毒表达载体GV248上，同时构建PRL-1过表达质粒，共转染293T细胞，Western Blot外源筛选最有效的PRL-1基因的RNAi靶序列。将LV-PRL1siRNA、及辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0这3种质粒根据Invitrogen公司所提供的Lipofectamine2000使用说明书，共转染293T细胞，包装产生慢病毒，荧光法加药筛法测定病毒滴度。将构建好的PRL-1基因重组慢病毒感染人舌癌Tca8113细胞株，采用荧光定量PCR实验及western blot实验检测PRL-1基因的沉默效果，同时我们使用嘌呤霉素筛选出稳定转染重组慢病毒及空白病毒的Tca8113细胞株。 2.实验设(1)空白对照组(CON)：未经任何处理的Tca8113细胞；(2)KD：稳定转染PRL-1重组慢病毒的Tca8113细胞(3) NC：转染空白病毒载体的Tca8113细胞。分别提取各组细胞总RNA及总蛋白，分别采用荧光定量PCR及western blot方法检测各组细胞中PRL-1、MMP-9、MMP-2表达情况。应用Transwell小室实验方法观察PRL-1基因沉默对舌鳞癌Tca8113细胞侵袭的影响。同时应用平板克隆形成实验观察PRL-1重组慢病毒感染对Tca8113细胞增殖活性的影响。建立裸鼠肿瘤模型，取各实验组对数期生长细胞，接种于裸鼠背部皮下，观察各组细胞裸鼠成瘤情况。 结果： 成功构建了PRL-1基因干扰慢病毒载体并获得相应的慢病毒，重组慢病毒可以有效沉默舌鳞癌Tca8113细胞中PRL-1基因的表达，与空白对照组相比，siRNA-PRL-1慢病毒转染组癌细胞PRL-1在RNA（0.4250±0.01）和蛋白（2.7200±0.11）水平明显下调（P=0.00，P=0.00），同时MMP2及MMP9在RNA（0.5622±0.18,0.6171±0.10）及蛋白(0.5924±0.01,0.4762±0.02)表达水平降低(P=0.024,P=0.010, P=0.00, P=0.00)；Transwell实验siRNA-PRL-1慢病毒转染组细胞通过数（64.33±4.04）明显减少（P=0.00）。平板克隆形成实验KD组细胞形成的克隆数（71.67±10.41）与CON组细胞形成克隆数（398.33±10.69）及NC组细胞形成克隆数（378.67±13.05）明显减少，差异有统计学意义（P0.01）。 结论： 1.成功构建了siRNA-PRL-1慢病毒表达载体，并筛选出稳定感染重组慢病毒及空白病毒细胞株。 2.siRNA-PRL-1基因重组慢病毒载体能有效沉默舌鳞癌Tca8113细胞中PRL-1基因的表达。 3.PRL-1重组慢病毒感染下调PRL-1基因的表达后人舌鳞癌Tca8113细胞的体外增殖、侵袭能力降低。 4.PRL-1基因表达降低，可引起基质金属蛋白酶-2和-9表达改变，MMP-2及MMP-9表达均降低。提示MMP9及MMP2基因表达下调，可能是PRL-1siRNA感染抑制舌癌细胞侵袭转移的重要途径。
[Abstract]:The purpose of the study is: 1. Aiming at PRL-1 gene, the recombinant lentivirus vector of PRL-1 gene was constructed to screen human tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cell line stably infected with siRNA-PRL-1 lentivirus and no-load virus. two銆

本文编号：2504366