转基因番茄防龋疫苗对SD大鼠脾脏基因表达变化的影响

发布时间：2020-03-21 19:10

【摘要】：目的:课题组保存了T_1代转基因番茄防龋疫苗种子和含有重组质粒pET30a-PAcA的大肠杆菌,在此基础上制备PAcA蛋白和多克隆抗体,培育T_2代转基因番茄,将其制作成纯番茄果汁后灌胃免疫SD大鼠产生免疫应答,利用RNA-seq从转录组水平研究脾脏基因变化,探讨转基因番茄防龋疫苗免疫机制。方法:1、PCR和质粒测序筛选含重组质粒pET30a-PAcA的大肠杆菌菌液。2、IPTG诱导大肠杆菌表达PAcA蛋白后超声破碎,纯化,Western Blot鉴定蛋白。3、鉴定正确的PAcA蛋白免疫新西兰大白兔,获取血清得到多克隆抗体。4、PCR对T_2代转基因番茄进行gus和pacA基因检测,筛选含有外源基因APB-DOCK8的阳性番茄果实。5、BCA检测T_2代转基因番茄果实总蛋白浓度,ELISA检测T_2代转基因番茄果实融合蛋白浓度,Western Blot检测融合蛋白的表达情况。6、动物实验:(1)动物选择及分组:25只3周龄健康雌性SD大鼠随机分为5组,每组5只,构建龋齿模型的基础上进行灌胃免疫。A组:2 mL/kg转基因番茄果汁组;B组:4 mL/kg转基因番茄果汁组;C组:6 mL/kg转基因番茄果汁组;D组:8 mL/kg转基因番茄果汁组;E组:10 mL/kg转基因番茄果汁组。(2)免疫时间:每周免疫一次,连续免疫4周。(3)样本收集:唾液和血液样本于第一次免疫前1天及每次免疫7天后收集,直至第7周。(4)抗体检测:唾液中特异性抗PAcA的SIgA和血清中特异性抗PAcA的IgG含量使用间接ELISA法检测。(5)SD大鼠处死后取上下颌骨进行Keyes经典龋齿计分。(6)确定转基因番茄果汁最佳免疫剂量和脾脏取样时间。该实验经动物伦理委员会审查通过。7、转录组测序:(1)20只3周龄健康雌性SD大鼠随机分为2组,每组10只,实验组:8 mL/kg转基因番茄果汁组,对照组:8 mL/kg正常番茄果汁组。(2)其余步骤同动物实验一。(3)第六周处死SD大鼠,提取脾脏总RNA,带有Oligo dT的磁珠富集mRNA后进行RNA-seq建库和测序分析;取上下颌骨进行Keyes经典龋齿计分。该实验经动物伦理委员会审查通过。结果:1、PCR和测序鉴定表明大肠杆菌的质粒中含有pacA基因,无突变。根据蛋白表达条件,获得浓度为0.8284 mg/mL的纯化PAcA蛋白,免疫新西兰大白兔后获得多克隆抗体。2、PCR测定T_2代转基因番茄果实DNA中标记基因gus和目的基因pacA,得到含外源基因APB-DOCK8的阳性番茄果实。3、T_2代转基因番茄果实总蛋白浓度为14.77 mg/mL,融合蛋白浓度为36.28μg/mL,所占比例为0.2456%。T_2代转基因番茄果实蛋白在173.5 KD大小处出现特异性条带,符合APB-DOCK8融合蛋白分子大小。4、动物实验表明,D组在第6周产生的SIgA和IgG抗体水平最高,且与其他组存在显著差异(P0.05),龋齿计分也较其他组差异有统计学意义(P0.05)。5、提取SD大鼠脾脏mRNA,经检测表明质量好,纯度高,生物学重复性较好;RNA-seq测序得到40个mRNA表达差异显著基因(P-adjust0.05|Fold Change|≥1.5),26个基因显著上调,14个基因显著下调。上调基因GO注释到88个条目,包括体液免疫反应(humoral immune response)、B细胞活化(regulation of B cell activation)等功能,且F0.001,统计学差异显著;下调基因GO注释到307个条目,但F0.4,差异无统计学意义。KEGG分析上调基因显著富集的信号通路56条,包括FcγR介导的吞噬作用(Fc gamma R-mediated phagocytosis)、产生IgA的肠道免疫网(intestinal immune network for IgA production)、B细胞受体信号传导通路(B cell receptor signaling pathway)等信号通路,且F0.001,统计学差异显著;下调基因富集的信号通路16条,分析后F0.1,无统计学差异。结论:1、制备PAcA蛋白和多克隆抗体,培育含有标记基因gus、目的基因pacA和目的蛋白APB-DOCK8的转基因防龋番茄,为后续实验的开展提供基础。2、转基因番茄果汁灌胃免疫SD大鼠后,在第6周时,8mL/kg的剂量组产生的特异性抗体水平最高。3、转基因番茄防龋疫苗免疫SD大鼠后产生特异性抗体,RNA-seq技术对其脾脏基因进行分析,其中,26个基因显著上调,14个基因显著下调。上调基因GO分析显著富集到与体液免疫相关的功能上,如B细胞活化、体液免疫反应,KEGG分析显著富集到B淋巴细胞活化、抗体产生等信号通路中;下调基因的GO分析和KEGG分析差异无统计学意义,因此判定疫苗通过上调脾脏相关免疫基因达到体液免疫效果,为深入研究疫苗机制提供理论依据。
【图文】：

SD大鼠灌胃免疫（5）样本收集

SD大鼠采集血液（7）唾液样本
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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本文编号：2593801