PEN载体传递ODN对骨髓间充质干细胞细胞增殖与成骨分化的影响

发布时间：2020-03-22 03:59

【摘要】：寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)是一种碱基数目通常少于五十个的脱氧核苷酸序列,存在于自然界某些低等生物基因组的DNA中,易于与它们的互补链相互对接。MT01是依据人线粒体DNA人工设计合成的含有27个碱基的特定序列ODN,通过胞吞作用进入细胞,可与Toll样受体9(Toll like receptor 9,TLR9)和Toll样受体7(Toll like receptor 7,TLR7)结合,增强人和大鼠成骨细胞内成骨标志性基因如Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ,COL-Ⅰ)和骨保护素(osteoprotegerin,OPG)等在mRNA水平的表达,从而促进成骨细胞的分化,但MT01易于被核酸酶降解且其表面的负电荷与细胞膜表面的负电荷存在静电排斥影响细胞摄取率,故有研究使用对MT01进行硫代修饰形成的MT01-S,虽然可以在一定程度上阻断细胞内的核酸酶对MT01的降解,但可能对机体造成一系列不良反应,因此本实验欲研究新型载体PEN可否用于装载游离的MT01使其更好地发挥效用。目的:本实验通过构建PEN/MT01复合物,检测其对BMSCs细胞增殖及细胞内成骨相关基因ALP、Runx2及COL-Ⅰ表达的影响,探讨PEN能否成为MT01的有效载体协同影响大鼠BMSCs的细胞增殖及分化过程。方法:首先,通过静电装载方式制备出PEN与MT01不同质量比例的7种混合物,即PEN与 MT01 的质量比例分别为:0.5:1、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1 和 10:1,形成7种不同的PEN/MT01复合物后对大鼠BMSCs进行细胞内的转染,检测BMSCs的细胞增值率,通过与单纯的PEN载体组以及空白对照组进行对比,筛选出需要进一步研究的PEN/MT01复合物的最佳质量比例。然后,分别设置游离的MT01组、MT01-S组和空白对照组,与筛选出的最佳质量比例的PEN/MT01复合物组进行对照,检测BMSCs细胞内ALP、Runx2及COL-Ⅰ的表达水平,评估该复合物是否对大鼠BMSCs的分化有影响。实验一:MTT比色法检测PEN/MT01复合物作用下BMSCs的细胞增殖率,目的是筛选出PEN与MT01的最佳装载质量比例;实验二:通过碱性磷酸酶试剂盒检测筛选出的PEN/MT01复合物对BMSCs细胞内成骨分化相关蛋白碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响;实验三:通过Real time-PCR法检测筛选出的PEN/MT01复合物对BMSCs细胞内成骨标志性基因Runx2和Collagen-Ⅰ在基因表达水平的影响;实验四:通过碱性磷酸酶染色,观察筛选出的PEN/MT01复合物对BMSCs体外成骨分化的影响;结果:BMSCs细胞增殖率检测结果表明,转染后第1天,PEN与MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物对BMSCs的细胞存活率影响最小,并且随时间的延长至转染后的第2天、第3天,PEN与MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物组BMSCs的细胞增值率均最高(p0.01),提示该比例复合物对BMSCs的细胞增殖有最佳促进作用,故筛选得出的PEN与MT01静电装载的最佳质量比例为2:1。BMSCs细胞内碱性磷酸酶活性检测实验中发现,在游离的MT01组、MT01-S组、2:1的PEN/MT01复合物组、6:1的PEN/MT01复合物组以及空白对照组中,在所检测的三个时间点即第1天、第3天和第5天,2:1的PEN/MT01复合物组BMSCs细胞内碱性磷酸酶活性的表达均最高(p0.01),优于MT01-S组及其他各组。BMSCs细胞内成骨标志性基因的Realtime-PCR检测实验表明,在游离的MT01组、MT01-S组、2:1的PEN/MT01复合物组以及空白对照组中,与空白对照组相比,其他三个组BMSCs细胞内成骨标志性基因Runx2和Collagen-Ⅰ的表达均有升高。其中,从成骨相关基因Runx2的检测结果来看,在第3天时,MT01-S组Runx2的表达高于其他三组,随时间的延长到转染后第5天,2:1的PEN/MT01复合物组Runx2表达显著升高(p0.01),明显高于其他组,基因表达显著的优势持续到转染后的第7天;从成骨相关基因Collagen-Ⅰ的检测结果来看,在第3天、第5天、第7天三个时间点,都是PEN和MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物组基因表达水平最高(p0.01),均优于其他组。碱性磷酸酶染色发现,PEN和MT01的质量比例为2:1的PEN/MT01复合物组碱性磷酸酶染色的颜色最深,其次分别是MT01-S组、游离的MT01组和空白对照组。结论:PEN可以用来做为一种载体去搭载MT01,能有效提高游离的MT01被细胞内吞的效率,PEN与MT01以不同质量比例装载形成的PEN/MT01复合物均可对骨髓间充质干细胞的细胞增殖产生影响,当PEN与MT01质量装载比例达到6:1时,细胞毒性开始逐渐显现,随着PEN/MT01复合物内PEN所占质量比例的增大,PEN/MT01复合物对BMSCs的细胞毒性也逐渐增大,当PEN与MT01的质量装载比例为2:1时大鼠BMSCs的细胞存活率最高,并且随时间的延长该比例的复合物对BMSCs的细胞增殖过程有最佳促进作用,故选取PEN与MT01质量比例为2:1的PEN/MT01复合物,研究其能否对BMSCs的成骨分化产生影响;本实验发现筛选出的2:1的PEN/MT01复合物可以增强BMSCs细胞内碱性磷酸酶在蛋白水平与骨改建相关因子Runx2和Collagen-Ⅰ在基因水平的表达,并且其增强效果优于MT01-S组、游离的MT01组以及空白对照组。
【图文】：

，。－良好，贴壁较均匀，倒置显微镜观察活体细胞形态：呈纤维状梭形有突起－１０ｄ时，细胞汇合成片其融合率可达到８０％，细胞多呈长梭形，且排列具性，可进行第一次传代培养，此后通过贴壁差异ＢＭＳＣｓ可在传代中逐渐得，传至第三代时细胞多呈长梭形，且排列具有方向性，生长状态良好（图２．邋１））逦ＢＭＳＣｓ的细胞接种：逡逑待上述细胞生长至第二代，其融合度为８０％－９０％，无菌ＰＢＳ冲洗２次，，２．５ｇ／白酶消化ｌ－２／ｎｉｎ，使用完全培养基终止细胞消化过程，转移入离心管离００邋ｒｐｍ，５ｍｉｎ）。离心后用完全培养基吹打均匀，重悬细胞，以每孔５０００于９６孔板内或以每孔１＞＜１０５个接种于６孔板内，为避免边缘效应的产生，６孔板周围各孔加入２００ｕｌ无菌ＰＢＳ进行封闭，最后将培养板置于３７°Ｃ、５％Ｃ０Ｉｄ，静待细胞贴壁。逡逑

第３章结果逡逑３．１邋ＰＥＮ／ＭＴ０１复合物对ＢＭＳＣｓ细胞增殖的影响逡逑如图３．１所示，在不同质量比例ＰＥＮ／ＭＴ０１复合物转染ＢＭＳＣｓ邋２４ｈ后，与空逡逑白对照组相比，实验中设置的７个复合物实验组及单纯载体组对ＢＭＳＣｓ的细胞增逡逑值均有抑制作用，当ＰＥＮ与ＭＴ０１质量比例小于６：１时，组间差异不是很明显，逡逑当ＰＥＮ与ＭＴ０１质量比例达到６：１时，细胞毒性开始较明显地逐渐显现，ＢＭＳＣｓ逡逑的细胞存活率逐渐下降，当ＰＥＮ与ＭＴ０１质量比例达到１０：１时，ＰＥＮ／ＭＴ０１复合逡逑物对ＢＭＳＣｓ的细胞毒性达到最大（Ｐ＜０．邋０１）邋（＊表示Ｐ＜０．邋０５，即有显著性的差逡逑异；＊＊表示Ｐ＜０．０１，即有非常显著性的差异）。逡逑ＭＴＴ邋Ｄａｙ１逡逑０．４－１逡逑＿＿＿＿＿逡逑图３．邋１不同质量比例ＰＥＮ／ＭＴ０１复合物转染ＢＭＳＣｓ邋２４ｈ后细胞增殖率逡逑如图３．２所示，在不同质量比例ＰＥＮ／ＭＴ０１复合物转染ＭＳＣｓ４８ｈ后，当ＰＥＮ与逡逑ＭＴ０１质量比例低于４：邋１时
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 廖立;苏晓霞;金岩;;抗氧化酶系统异常导致衰老骨髓间充质干细胞的成骨分化能力下降[J];口腔生物医学;2015年03期

2 刘小云;刘一舟;罗映红;刘佳;;中药骨碎补水煎液对间充质干细胞成骨分化的作用[J];人人健康;2017年08期

3 刘之川;简华刚;王丽华;梅英;;体外联合培养体系中人脐静脉内皮细胞对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制[J];中国老年学杂志;2014年18期

4 董晨露;刘笑涵;吴琳;;骨髓间充质干细胞成骨分化的研究与进展[J];中国骨伤;2019年03期

5 付丹丹;;促骨髓基质干细胞成骨分化因子研究现状[J];菏泽医学专科学校学报;2014年02期

6 彭飞;郑亚东;徐西强;虞冀哲;吴华;;620nm低能量红光对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响[J];激光生物学报;2011年03期

7 牛玉明;胡媛媛;冷卫东;解龙川;贺维;陈永吉;;碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松联合诱导骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[J];郧阳医学院学报;2010年01期

8 王博;王东;施文军;诰建飞;刘喜全;;阿伦磷酸钠对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响[J];中国医疗前沿;2009年22期

9 王晶;张洹;;-80℃一步法冻存对成人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响[J];广东医学;2007年03期

10 耿英楠;韦敏;毛豪丽;;大分子拥挤对脂肪干细胞增殖及其成骨分化能力的影响[J];组织工程与重建外科杂志;2018年06期

相关会议论文 前10条

1 曹凤仪;龙月;卓仁禧;张先正;;荧光纳米探针用于干细胞早期成骨分化检测[A];2015年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题F-生物医用高分子[C];2015年

2 郑亮;郑雅元;崔燎;刘钰瑜;;四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制研究[A];中华医学会第七次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议论文汇编[C];2013年

3 吴江;陈槐卿;李良;尹光福;K-L P．SUNG;;钛颗粒负荷影响骨髓间充质干细胞成骨分化能力的机理[A];中国复合材料学术研讨会论文集[C];2005年

4 吴江;陈槐卿;K-LP.SUNG;;钛颗粒负荷影响骨髓间充质干细胞成骨分化能力的机理[A];全国首届青年复合材料学术交流会论文集[C];2007年

5 林佳琳;张平;沈想;徐荣耀;朱伟文;傅瑜;江宏兵;;糖尿病骨髓间充质干细胞自噬,衰老及成骨分化特征[A];2018全国口腔生物医学学术年会论文汇编[C];2018年

6 徐谦;崔亚洲;栾静;周小艳;时良;崔笑笑;刘静;韩金祥;;成肌细胞外泌体促成骨分化的作用及机制研究[A];2017第七届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集[C];2017年

7 袁风红;邹耀红;高恺言;俞可佳;;地塞米松对体外人骨髓基质细胞增殖及成骨分化的影响[A];全国自身免疫性疾病专题研讨会暨第十一次全国风湿病学学术年会论文汇编[C];2006年

8 陈海啸;洪盾;万晓晨;李继承;;肠毒素C联合维生素C对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响研究[A];2008年浙江省骨科学学术年会论文汇编[C];2008年

9 刘仰;李洁;陈雪英;葛雅平;房思炼;;α2-巨球蛋白对电离辐射下人骨髓间充质干细胞成骨分化的保护作用[A];2017全国口腔颌面——头颈肿瘤外科学术研讨会论文集[C];2017年

10 张秀梅;崔亚洲;韩金祥;;韧带成纤维细胞成骨分化过程mRNA和蛋白表达谱分析[A];泛环渤海地区九省市生物化学与分子生物学会——2011年学术交流会论文集[C];2011年

相关博士学位论文 前10条

1 邱小玲;LINC00707通过miR-370-3p调控WNT2B影响人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究[D];南方医科大学;2018年

2 元宇;MiR-214在机械应力促进成骨分化中的作用研究[D];上海体育学院;2017年

3 万永鲜;自噬对骨质疏松间充质干细胞成骨分化能力的影响[D];重庆医科大学;2017年

4 贾搏;LncRNA-PCAT1对人牙周膜干细胞成骨分化调控机制的研究[D];南方医科大学;2018年

5 王鼎;股骨头TNF-α含量及表观学修饰调控TNF-α对BMMSCs成骨分化影响的作用机制研究[D];广州中医药大学;2018年

6 周呈瑶;先天性脊柱侧凸患者骨髓间充质干细胞成骨分化能力评估研究[D];北京协和医学院;2018年

7 杨博;Amyloid β_(1-42)对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响及机制研究[D];中国医科大学;2018年

8 彭宇飞;中药关节腔灌注对激素型股骨头坏死MSCs调控机制的研究[D];黑龙江中医药大学;2017年

9 王琪炜;氧化铁纳米颗粒协助促进间充质干细胞成骨分化效应研究[D];东南大学;2018年

10 陈霞;Osteoglycin在脂肪-骨联系中的作用研究[D];南京医科大学;2018年

相关硕士学位论文 前10条

1 安小宁;PNS介导BMP-Smad信号通路调控BMSCs成骨分化的机制研究[D];广西医科大学;2019年

2 李云;静压力对人牙周膜干细胞成骨分化的影响[D];广西医科大学;2019年

3 覃玲;BMP9对静压力作用下人牙周膜干细胞成骨分化的影响[D];广西医科大学;2019年

4 谢玉;纳米HA-PNS-LIP靶向CD44对兔BMSCs成骨分化的研究[D];广西医科大学;2019年

5 张小敏;少阳生骨方对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制研究[D];西南医科大学;2019年

6 吴璐;ARL6调控Wnt/β-catenin通路在镉所致骨髓间充质干细胞成骨分化抑制中的作用及分子机制[D];南京医科大学;2019年

7 罗亚东;张应力通过下调miR-503-3p表达靶向增高Wnt7b表达促进人脂肪干细胞成骨分化[D];南京医科大学;2019年

8 邱申彩;NICD的过表达对人牙周膜干细胞增殖及成骨分化影响的实验研究[D];新疆医科大学;2019年

9 李文洁;PEN载体传递ODN对骨髓间充质干细胞细胞增殖与成骨分化的影响[D];吉林大学;2019年

10 徐超;介孔Fe_3O_4基纳米输送体系的构建及其在外磁场作用下促成骨效应研究[D];武汉理工大学;2018年

本文编号：2594440