小鼠骨髓间充质干细胞悬液短期保存的可行性及DNA酶Ⅰ预处理降低静脉注射风险性研究

发布时间：2020-03-24 10:40

【摘要】：目的：本研究为前期本实验室将异体同种骨髓间充质干细胞（Bone marrowmesenchymal stem cells BMSCs）悬液经山羊颈静脉注射致急性肺栓塞发生故设计探索性的实验，目的在于比较4℃恒温条件下短期保存对小鼠骨髓间充质干细胞（C57-BMSCs）的细胞活性及生物学特性是否产生影响，为短期安全有效的保存BMSCs提供参考，探索使用DNA酶Ⅰ（DeoxyribonucleaseⅠ DNaseⅠ）预处理后的注射用BMSCs经尾静脉注射至同种异体小鼠体内的移植方式，能够起到降低直接血管内移植导致发生急性肺栓塞的风险。为将来在临床或口腔组织工程领域应用提供安全性参考。方法：（1）体外无菌分离培养纯化C57-BMSCs，鉴定BMSCs的骨向、脂向分化能力，经流式对其的表面分子标志物表达程度检测。（2）磷酸盐的缓冲液（PhosphateBuffered Saline PBS）作为C57-BMSCs的短期储存液，直接将BMSCs置于4℃恒温保存，存储0h、4h、12h、24h及48h后取试样，镜检细胞、测算统计活细胞比例、比较增殖和分化能力。（3）对正常C57-BMSCs和DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs悬液细胞聚集状态及体外增殖、分化能力进行比较。（4）将体外分离、培养、纯化后的C57-BMSCs扩增至第三代。将C57小鼠随机分为四组：注射PBS组（n=30）、注射10U/mlDNaseⅠ-PBS组（n=30）、注射正常C57-BMSCs组（n=30）、注射DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs组（n=30）。（5）注射PBS组与注射正常C57-BMSCs组每只小鼠以5ml/kg的比例，分别经尾静脉注射相应剂量的PBS或本实验室前期试验摸索得到（3×106cell）的临界致死剂量C57-BMSCs，取急性死亡小鼠脏器做组织学检测，，注射PBS组做对照，观察记录并统计急性死亡率。（6）注射DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs组，每只小鼠按5ml/kg比例注射DNaseⅠ预处理后3×106个C57-BMSCs观察急性死亡率。结果：（1）于4℃恒温条件下短期保存C57-BMSCs4h、12h和24h后取样镜下观察见良好的形态、活细胞占80%左右，细胞增殖、分化能力上相比于0h无统计学意义（P0.05）；48h取样后镜下见悉数视野的死细胞和细胞碎片、仅20%左右为活细胞，与0h相比细胞增殖、分化能力上存显著性差异（P0.05）。（2）DNaseⅠ预处理不影响C57-BMSCs增殖、分化能力（P0.05）；DNaseⅠ预处理C57-BMSCs与正常C57-BMSCs相比细胞聚集成团比例显著降低（P0.05）。（3）与注射PBS组相比，注射正常C57-BMSCs组的急性死亡率是60%、组织学检测发现心肺异常并且肺血管内有异染物质，诱发了急性肺栓塞。（4）注射DNaseⅠ预处理后C57-BMSCs组的急性死亡率降为23.3%，与注射正常C57-BMSCs组相比有统计学差异（P0.05）。结论：（1）4℃恒温条件下24h内短期保存C57-BMSCs为一种简单易行的保存方法。但是，细胞生物学特性与活性随保存时间延长是呈逐渐下降的，并直至丧失。（2）DNaseⅠ预处理不影响C57-BMSCs的生物学特性,DNaseⅠ能够降低经静脉注射移植C57-BMSCs悬液中单个细胞间聚集所诱发急性肺栓塞风险的发生。为将来临床或口腔组织工程领域的应用提供了一定的安全性参考。
【图文】：

间充质干细胞,图片

图1-1 C57 小鼠骨髓间充质干细胞培养镜下图片（20×）注：a 为原代C57-BMSCs；b 为一代C57-BMSCs；c 为二代C57-BMSCs；d 为三代C57-BMSCs。图1-2 C57-BMSCs 成骨诱导 7 天ALP、21 天茜素红染色注：a 正常培养7d ALP 染色大体照及镜下（20×）；b 成骨诱导7d ALP 染色大体照及镜下（20×）；c 正常培养21d 茜素红染色大体照及镜下（20×）；d 成骨诱导21d茜素红染色大体照及镜下（20×）。

小鼠骨髓间充质干细胞悬液短期保存的可行性及DNA酶Ⅰ预处理降低静脉注射风险性研究

C57-BMSCs成骨诱导7天ALP、21天茜素红染色注：a正常培养7dALP染色大体照及镜下（20×）；b成骨诱导7dALP染色大体照及镜下（20×）；c正常培养21d茜素红染色大体照及镜下（20×）；d成骨诱导21d茜素红染色大体照及镜下（20×）
【学位授予单位】：佳木斯大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781.05

【参考文献】