乏氧对脂多糖诱导的人牙周膜细胞炎症免疫反应的影响

发布时间：2020-03-27 01:42

【摘要】：背景与目的:牙周病是常见的口腔疾病,是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一,但却往往被人们所忽视。牙周病的致病因素有很多,其中最主要的致病因素是菌斑生物膜,是由菌斑的细菌及其代谢产物作用于牙周组织从而激活宿主炎症免疫反应导致牙周组织破坏的一种炎症性疾病。当人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDLCs)受到致病菌及其代谢产物刺激时,hPDLCs自身可分泌多种细胞因子和化学介质参与局部免疫反应。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是公认的炎症启动因子,可通过刺激免疫细胞和局部邻近组织细胞增加炎症因子的表达,进而诱导宿主发生一系列免疫反应。白介素-6(Interleukin-6,IL-6)与炎症、自身免疫疾病等密切相关,炎症免疫反应发生后,IL-6率先生成,参与牙周组织慢性炎症过程。白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)又称为趋化因子CXCL-8,是趋化因子家族的一种细胞因子。IL-8结合受体α(CXCR-1)和受体β(CXCR-2)通过趋化、聚集并激活中性粒细胞,发生脱颗粒作用释放溶酶体酶促进炎症介质的释放,而实现其对炎症免疫反应的调节,达到杀菌和细胞损伤的目的。TLR-2(Toll-like receptor-2,TLR-2)、TLR-4(Toll-like receptor-4,TLR-4)是I型跨膜蛋白,属于模式识别受体,它们都在LPS激发的炎症免疫反应中起重要作用,是细菌破坏细胞的关键途径。当炎症发生时,局部炎症组织及细胞处于乏氧微环境中,因此在乏氧微环境下对牙周炎症的研究更接近牙周炎时真实的牙周组织微环境。目前,国内外关于乏氧和LPS分别对hPDLCs的影响的研究已经比较广泛和深入,但乏氧条件下研究LPS对hPDLCs免疫反应的影响鲜见报道。本实验旨在乏氧环境下培养经LPS诱导的hPDLCs,模拟真实情况下牙周炎症组织局部乏氧的病理模型,通过检测IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的表达情况分析乏氧对LPS诱导的hPDLCs炎症免疫反应的影响,以期为牙周病的治疗提供新思路。材料和方法:1、组织块法原代培养hPDLCs;2、取第4代hPDLCs,流式细胞术检测细胞分子表型对细胞进行鉴定;3、取第3代hPDLCs,CCK-8法检测细胞增殖情况;4、模型建立及实验分组:取第4代生长良好的hPDLCs随机分为4组:(A组)常氧+无LPS、(B组)常氧+LPS、(C组)乏氧+无LPS、(D组)乏氧+LPS。培养6h、12h、24h、48h后收集各组细胞,分别用Realtime-PCR检测IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4mRNA的表达;5、模型建立及实验分组:取第4代生长良好的hPDLCs随机分为4组:(A组)常氧+无LPS、(B组)常氧+LPS、(C组)乏氧+无LPS、(D组)乏氧+LPS。培养6h、12h、24h、48h后收集各组细胞及其上清液,分别用酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay,ELISA)检测各组IL-6、IL-8的表达和流式细胞术检测各组TLR-2、TLR-4的表达。结果:1、组织块法体外培养成功获得hPDLCs;2、流式结果示:所培养细胞为间充质来源,符合成纤维细胞的生物学特性;3、CCK-8结果示:细胞生长呈“S”形,符合成纤维细胞生长规律;4、Realtime-PCR结果从基因水平上说明:与对照组相比,乏氧(1%02)或LPS刺激对hPDLCs炎症因子IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4mRNA的表达有显著促进作用,且乏氧(1%02)能增强LPS诱导的IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4 mRNA的表达;5、ELISA和流式细胞术结果从蛋白水平上说明:与对照组相比,乏氧(1%02)或LPS刺激对hPDLCs炎症因子IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的蛋白表达有显著促进作用,且乏氧(1%O2)能增强LPS诱导的IL-6、IL-8、TLR-2、TLR-4的蛋白表达。结论:1、乏氧及脂多糖均可诱导hPDLCs炎症因子的表达。2、乏氧可增强脂多糖诱导的hPDLCs炎症因子表达。
【图文】：

、原代ｈＰＤＬＣｓ的形态学观察逡逑组织块法培养５ｄ后，，镜下观察发现部分组织块周围有细胞游出，细胞贴壁逡逑生长（图１Ａ）；组织块法培养１０ｄ后，镜下观察发现部分组织块周围发亮，以逡逑组织块为中心，细胞游出并呈放射状或漩涡状排列生长，细胞形态多呈梭形，细逡逑胞核呈圆形或卵圆形位于细胞中央，为成纤维细胞样细胞（图１Ｂ）；组织块法逡逑培养１４ｄ后，镜下观察发现部分组织块崩解，细胞多呈放射状或漩涡状排列（图逡逑１Ｃ）；传代培养后，ｈＰＤＬＣｓ生长状态稳定、良好（图１Ｄ）。逡逑Ｍ邋■逦▲．．逡逑Ｃ逦＿邋Ｄ逦＿逡逑ａ＊ｔｉｍ逦ｍｔ０？逡逑图１组织块法培养ｈＰＤＬＣｓ逡逑（Ａ）培养邋５ｄ邋的邋ｈＰＤＬＣｓ；邋（Ｂ）培养邋ｌＯｄ邋的邋ｈＰＤＬＣｓ；逡逑（Ｃ）培养１４ｄ的ｈＰＤＬＣｓ；邋（Ｄ）传代培养后的ｈＰＤＬＣｓ。逡逑二、流式细胞术检测细胞分子表型逡逑流式细胞术检测所培养的ｈＰＤＬＣｓ，邋ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０抗体标记的阳性逡逑细胞率分别为邋９８．４％、９７．８％、９６．８％邋（图邋２Ａ，图邋２Ｂ，图邋２Ｃ），ＣＤ３１、ＣＤ３４、逡逑ＣＤ４５抗体标记的阳性细胞率分别为０．４％、０．２％、０．５％邋（图２Ｄ，图２Ｅ，图２Ｆ），逡逑说明此细胞为间充质来源

细胞生长呈“Ｓ”形，接种后第１天细胞开始增殖但速度较慢，第３？６天细胞逡逑快速增殖，第７天开始细胞增殖减缓，在第９天达到生长最高峰，之后细胞数量逡逑开始减少，符合成纤维细胞生长规律（图３）。逡逑０－１逦１逦１逦１逡逑０逦５逦１０逦１５逡逑Ｔｉｍｅ邋（ｄ）逡逑图３邋ＣＣＫ－８法检测ｈＰＤＬＣｓ增值曲线逡逑２２逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781.4

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本文编号：2602266