唾液酸酶抑制剂2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸抑制牙周致病菌牙龈卟啉单胞菌致病性的研究

发布时间：2020-03-30 05:46

【摘要】：目的:慢性牙周炎是一种以牙周致病菌为始动因子、宿主免疫反应介导的复杂的慢性感染性疾病。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎的主要致病菌。P.gingivalis唾液酸酶基因是P.gingivalis编码唾液酸酶的唯一基因,敲除该基因可以严重影响其荚膜合成、生物膜形成及牙龈素活性等,降低P.gingivalis抵抗宿主免疫防御的能力,在慢性牙周炎的发生发展过程中起到了重要的作用。因此,抑制唾液酸酶基因转录、表达或其产物(唾液酸酶)的活性,有望成为预防、减缓或治疗慢性牙周炎发生发展的新方向。2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)是唾液酸的重要衍生物,对某些细菌唾液酸酶具有较高的抑制效能。本研究目的是通过唾液酸酶抑制剂DANA抑制P.gingivalis唾液酸酶活性后,研究P.gingivalis的生长情况及毒力因子的变化,旨在探索DANA影响抑制牙周致病菌P.gingivalis致病性的可能机制,为应用DANA进行慢性牙周炎的预防和治疗提供新的研究思路和理论依据。研究方法:本实验选用P.gingivalis W83作为实验菌株,采用MTS法检测不同浓度广谱唾液酸酶抑制剂DANA和流感病毒唾液酸酶特异性抑制剂奥司他韦对人单核细胞U937的毒性作用,再使用不同浓度DANA和奥司他韦处理P.gingivalis后采用荧光法检测唾液酸酶活性,联合确定DANA作用于P.gingivalis的合适浓度。1 mM DANA作用于P.gingivalis W83(实验组),用未加药物的P.gingivalis W83作对照,通过酶标仪检测OD_(600),绘制生长曲线;通过透射电镜观察细菌的形态;体外形成生物膜,通过活/死菌荧光染色及激光共聚焦显微镜观察生物膜的结构变化;Real-time PCR法检测菌毛基因fimA、fimR和fimS的表达情况;使用蛋白底物测定赖氨酸蛋白酶(Kgp)和精氨酸蛋白酶(Rgps)的活性;通过基质显色法鲎试剂盒检测脂多糖(LPS)的活性。结果:1、MTS法结果显示,当DANA浓度为0.1、1、10mM时,人单核细胞U937的相对增殖率分别为97.61±2.68%、93.75±7.87%和60.98±5.80%;当奥司他韦浓度为0.1、1、10 mM时,人单核细胞U937的相对增殖率分别为96.59±2.93%、93.35±3.86%和76.93±10.05%。唾液酸酶活性测定实验表明DANA对P.gingivalis唾液酸酶活性产生了抑制作用,且抑制作用显著强于奥司他韦。当DANA浓度为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mM时,唾液酸酶活性抑制率分别达47.13%、59.15%、72.01%、72.69%、72.79%、71.77%。因此,在后续实验中我们选择使用1 mM的DANA,使其对细胞仅产生适当的毒性作用且能明显抑制P.gingivalis唾液酸酶活性。2、通过生长曲线可观察到浓度为1 mM的DANA可明显抑制P.gingivalis的生长。通过活/死菌荧光染色及激光共聚焦显微镜观察P.gingivalis生物膜,发现实验组细菌生物膜中绿色活菌数量显著少于对照组;对照组细菌生物膜平均厚度为54μm,而实验组的平均厚度仅为33μm。3、透射电镜观察细菌形态发现,1 mM的DANA作用下P.gingivalis细菌悬液中细菌形态正常,细胞壁和细胞膜结构完整,其与未经处理的P.gingivalis的细胞结构相似。4、与对照组比较,实验组fimA、fimR和fimS基因mRNA表达分别下降76.34%±6.59%、42.55%±6.77%和50.02%±5.24%,组间差异均有统计学意义。实验组和对照组的Kgp活性的OD值分别为0.53±0.02和0.62±0.03;Rgps活性的OD值分别为0.72±0.07和0.96±0.08,实验组Kgp和Rgps活性均低于对照组,差异具有统计学意义。实验组与对照组的LPS活性相比无显著性差异。结论:浓度为1 mM的DANA可显著抑制P.gingivalis唾液酸酶活性,影响P.gingivalis的生长及生物膜的形成,降低菌毛基因的表达,影响牙龈素的活性,有望成为预防及治疗慢性牙周炎的新型药物。
【图文】：

脱氢,化学结构式,维生素

1 2-脱氧-2,3-二脱氢-N-乙酰神经氨酸（DANA）的化学结构式及细胞3（由中国医科大学口腔医学院口腔生物学教研室提供37 （购自北京贝纳创联生物科技有限公司）胞的培养valis W83 菌株接种于新鲜配制的含有维生素 K（1 μg/m和 5%无菌脱纤维绵羊血的 TSB 固体培养基中，37℃厌80% N2）5-7 d 后，将其置于含有维生素 K（1 μg/mL）的 TSB 液体培养基中增菌，待用。U937在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在3养箱中进行培养，800 rpm/min 离心 5 min，换液。台盼

影响图,奥司他韦,单核细胞,唾液酸酶

3 结果3.1 DANA 对人单核细胞 U937 增殖的影响图2显示了MTS法分析结果显示0.1 mM和1 mM的DANA对人单核细胞U937无明显的细胞毒性作用，0.1 mM、1 mM 和 10 mM 的奥司他韦对人单核细胞 U937无明显的细胞毒性作用。在本实验结果中，当 DANA 浓度为 0.1 、1 和 10 mM 时，人单核细胞 U937 的相对增殖率分别为 97.61 ± 2.68％、93.75 ± 7.87％和 60.98 ±5.80％；当奥司他韦浓度为 0.1 、1 和 10 mM 时，人单核细胞 U937 的相对增殖率分别为 96.59 ± 2.93％、93.35 ± 3.86％和 76.93 ± 10.05％。图 2 不同浓度的 DANA 及奥司他韦对人单核细胞 U937 增殖的影响（*P < 0.05）3.2 DANA 对 P. gingivalis 唾液酸酶活性的影响图 3 显示了不同浓度的 DANA 及奥司他韦处理后的 P. gingivalis W83 唾液酸酶相对活性。当 DANA 浓度为 0.2、0.5、1、1.5、2、2.5 mM 作用于 P. gingivalis W83时，P. gingivalis W83 唾液酸酶相对活性分别为 52.87%、40.85%、27.99%、27.31%、27.21%、28.23%，即唾液酸酶活性抑制率分别达 47.13%、59.15%、72.01%、72.69%、72.79%、71.77%。当奥司他韦浓度为 0.2、0.5、1、1.5、2、2.5 mM 作用于 P. gingivalisW83时，，P. gingivalis W83唾液酸酶相对活性分别为79.54%、74.38%、70.14%、65.17%、71.71%、78.63%
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781.4

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