葡萄糖酸锌碳点在细胞成像及体外促进成骨分化中的作用

发布时间：2020-03-31 23:35

【摘要】：背景:骨组织在不断更新改建中维持着动态平衡,成骨细胞和破骨细胞为其主要执行参与者。在口腔临床应用中,骨量丢失多由牙周炎、肿瘤和外伤等原因导致。牙槽骨的代谢和组织改建是人身体内所有骨骼中最为活跃的。当牙周炎等原因侵袭牙槽骨时,引起骨吸收的同时牙支持组织也相继丧失,牙齿松动度也逐渐增大,最终牙齿脱落或者被动拔除。这些对于患者来说,不仅影响其生理功能如咀嚼、发音等,还影响其身心健康。然而,目前的骨缺损相关治疗方法还伴随着一些弊端,例如不可避免的供体部位缺损、来源有限及免疫反应等不足。因此,急需寻找一种新的骨再生材料。荧光碳点(carbon dots,CDs)是一种光活性纳米材料,其结构相对简单、粒径小、毒性小和穿透率强,近年来备受学者们广泛关注。本研究探讨葡萄糖酸锌碳点在细胞成像及其体外促进成骨分化作用中的效果,为进一步开展葡萄糖酸锌碳点的生物学应用提供科学的理论依据。方法:1.碳点的合成:采用一步水热法,以葡萄糖酸锌作为原料合成葡萄糖酸锌碳点。2.碳点的表征:通过透射电子显微镜(TEM)观察碳点的尺寸、形貌,傅立叶变换得到样品红外光谱(FT-IR),荧光光谱仪扫描获取样品的荧光光谱。3.碳点的细胞毒性检测:将小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1与梯度浓度碳点(0、0.01、0.1、1、10、100、1000μ g/mL)浸提液共培养。通过MTT法考察碳点的细胞毒性。4.碳点的细胞摄取率检测:通过流式细胞技术定量分析MC3T3-E1细胞对碳点的摄取情况。5.碳点的荧光成像:应用激光共聚焦成像观察最佳使用浓度下MC3T3-E1细胞的成像特点。6.梯度浓度碳点的促成骨活性检测:将MC3T3-E1细胞与梯度浓度碳点(0、0.01、0.1、1、10、100μg/mL)浸提液共培养3,7和14天,通过应用碱性磷酸酶试剂盒检测细胞内碱性磷酸酶表达情况和qRT-PCR技术检测成骨相关基因mRNA表达。并在共培养21天后,通过茜素红染色检测矿化程度。结果:1.碳点的合成及表征:TEM结果表明成功合成5.25 nm的碳点,FT-IR结果表明主要由羟基和羧基基团构成碳点的表面,荧光光谱表明碳点的激发、发射光谱广泛。2.碳点的毒性:MTT结果显示碳点浓度在100 μg/mL以下,细胞毒性不明显。3.碳点的摄取率:流式细胞分析结果显示,100 μg/mL碳点处理6h后,细胞摄取率高达95%以上并稳定维持,表明碳点能有效被MC3T3-E1细胞摄入。4.碳点荧光成像结果显示:MC3T3-E1细胞可以呈现蓝色、绿色和红色的荧光图像。5.促成骨分化活性相关检测结果:第3、7和14天时,碱性磷酸酶相应活性随碳点浓度的增加而升高;Runt相关转录因子2基因(Runx2)、碱性磷酸酶基因(Alp)和骨钙素基因(Ocn)表达也随碳点剂量的增加而升高;第21天时,茜素红染色结果显示各浓度碳点钙结节量均比对照组多,也呈剂量依赖性。结论:1.合成的葡萄糖酸锌碳点的平均尺寸为5.25 nm,具有激发波长依赖特性的球形碳纳米颗粒。2.葡萄糖酸锌碳点生物相容性良好,能够被MC3T3-E1细胞有效摄取,并能激发呈现多色荧光图像。3.葡萄糖酸锌碳点对MC3T3-E1细胞具有促成骨分化作用。
【图文】：

照片,虚线圆,照片,晶格间距

３．１碳点的表征逡逑３．１．１碳点的大小形态及分布逡逑ＴＥＭ观察可见碳点是仿球形颗粒，且分散均匀（图３．１）。随机选取５０个逡逑碳点，通过Ｎａｎｏ邋Ｍｅａｓｕｒｅｒ软件计算直径，其粒径约为５．２５邋ｎｍ。ＨＲＴＥＭ观察可逡逑见碳点具有晶格条纹，且晶格间距为０．２０邋ｎｍ，与石墨结构晶格间距相近。逡逑图３．１碳点的（Ａ）邋ＴＥＭ和（Ｂ）邋ＨＲＴＥＭ照片，虚线圆圈内为碳点逡逑３．１．２邋ＦＴ－ＩＲ邋结果逡逑从ＦＴ－ＩＲ中（图３．２）可以看出，碳点表面不仅有羟基，还有羧基官能团，逡逑３５００邋ｃｍ－１左右处与０－Ｈ的伸缩振动峰对应，１５００邋ｃｍ－１左右处与Ｃ＝０的振动峰逡逑对应，１０００邋ｃｍ－１左右处与Ｃ－０的伸缩振动峰对应，这些基团赋予了碳点良好的逡逑水溶性和进一步表面修饰的可能性，使其在生物医学领域将具有更好的应用前逡逑里逡逑0逡逑１２逡逑

傅立叶红外光谱,激发波长,光谱

３００邋ｎｍ￣４００邋ｎｍ代表对应的激发波长，每一条激发波长光谱在横坐标上具有其相逡逑对应的发射波长。当激发波长为３６０邋ｎｍ时，碳点溶液具有最佳发射效应，其发逡逑射波长为４５０邋ｎｍ邋（图３．３）。逡逑■■■■■＇逦３００逡逑ｒ＼邋—ｉｉ°0逡逑函逡逑３５０逦４００逦４５０逦５００逦５５０逦６００逦６５０逡逑Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ邋（ｎｍ）逡逑图３．３碳点的光谱结果逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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