PLGA微球缓释rhIGF-1对粘附于纯钛表面2型糖尿病人牙槽骨成骨细胞的诱导分化作用

发布时间：2020-04-01 23:40

【摘要】：口腔种植学作为一门新兴学科，近些年来一直受到人们的关注。种植牙被称为“人类的第三副牙齿”，并成为目前最为理想的缺牙修复方式。但许多全身系统性疾病，例如：心血管疾病、糖尿病、骨代谢性疾病、出血性疾病、自身免疫性疾病等，它们经常导致种植修复的最终失败，极大地限制了种植技术的推广。尤其随着人们生活水平的提高、饮食结构的改变，糖尿病特别是2型糖尿病患病人数呈逐年上升趋势。基于这一现状，我们课题组进行了前期的动物实验，证实了种植失败的主要原因是种植体周围不能形成良好的骨性结合，指出了成骨细胞的形成与分化是影响骨结合的关键所在，所以我们很有必要对2型糖尿病患者的牙槽骨成骨细胞的生物学特性从细胞生物学角度进行初步研究，用具有理想控释系统的微球局部持续释放多肽性生长因子进行干扰，分析其对成骨细胞的诱导分化作用，为下一步临床就如何提高2型糖尿病患者种植牙成功率这一棘手问题提供理论和实验基础。研究内容和目的：临床中，采集接受口腔种植的2型糖尿病患者和正常患者牙槽骨剩余骨碎屑，分别进行体外培养，分析生物学特性，进行对比研究，证实2型糖尿病患者牙槽骨成骨细胞的生物学活性较正常人差，为后续研究提供实验载体。利用具有良好生物相容性、可降解性，且无毒副作用的生物聚合物PLGA，采用水/油/水（W/O/W）双层乳液法，包裹多肽性生长因子rhIGF-1，制备成具有持续释放能力的缓释微球，对微球的大小、形态作扫描电镜（SEM）观察，并作体外释放动力学实验，绘制其曲线，分析微球的持续释放能力。在同一细胞计数的情况下，PLGA包裹的rhIGF-1和安慰剂两种微球分别加入两组载有钛片的2型糖尿病患者牙槽骨成骨细胞的培养皿中，利用rhIGF-1的持续释放作用分析对其成骨细胞的诱导分化作用，为下一步临床应用研究奠定实验基础，从而也为解决2型糖尿病患者种植牙失败率高这一棘手问题进行有效探索。实验方法和结果：第一部分：方法：无菌条件下，收集3组接受口腔种植的2型糖尿病患者和正常患者牙槽骨剩余骨碎屑，采用组织块法进行体外培养，倒置显微镜观察细胞的形态，取第四代细胞用于实验研究，碱性磷酸酶（ALP）化学染色法检测成骨细胞的活性，茜素红（Alizarin red）染色法进行细胞成骨特性的检测，，噻唑蓝（MTT）比色法检测两种细胞的增值趋势，酶动力学的方法作碱性磷酸酶（ALP）活性定量测定，放射免疫的方法测定骨钙素（BGP）的浓度，酶联免疫分析（ELISA）的方法进行细胞上清液中Ⅰ型胶原（COL-Ⅰ）浓度的检测。结果：（1）同等培养条件下，二者的形态无明显差异，但2型糖尿病牙槽骨成骨细胞较正常人细胞生长慢、活性弱及矿化结节形成少；2型糖尿病成骨细胞上清液中ALP、BGP及COL-Ⅰ含量均较对照组低（P 㩳0.05）。（2）2型糖尿病人的成骨细胞在含低糖的DMEM培养基中生长缓慢，在其高糖培养基中却生长较快，而正常成骨细胞则在低糖或高糖培养基中差异不明显。第二部分：方法：以rhIGF-1加蒸馏水形成W1相，Span80和PLGA作为O相，二相结合形成W1/O初乳液，最后与W2相（tween80和PVA组成）形成W1/O/W2双层乳液，蒸发溶剂后形成所需微球。对微球作扫描电镜分析，观察其大小、形态以及质地是否均匀。通过累积释放率绘制释放动力学曲线，以观察微球的持续释放效能。结果：（1）实验所获微球的表面形态较光滑，大小较均匀。微球粒径约为1.4076±0.5238μm。包封率约为82.3±1.8%。（2）从绘制的释放动力学曲线可以看出，所得到的微球具有良好的释放能力，开始时释放较快，前20天累积释放率约为84%，以后逐渐减慢，大约40天释放完毕。第三部分：方法：在培养孔中放入钛片，加入细胞悬液，培养一定时间后，取出钛片，进行细胞非特异性荧光染色，证实两种细胞与钛片的贴附。在同一细胞计数的情况下，6孔培养板中，每孔均匀放置8枚钛片，细胞长满后，进行细胞计数，分析培养皿中两种细胞与钛片的结合能力。同样方式，把rhIGF-1微球和PLGA包裹的安慰剂微球分别加入两组载有钛片的2型糖尿病人牙槽骨成骨细胞的培养皿中（因放入8枚钛片过于拥挤，不利于细胞的观察和换液，改置每孔放入5枚钛片），细胞爬满后计数，证实rhIGF-1微球对钛片上细胞的诱导作用。结果：（1）非特异性荧光染色显示两种细胞均匀地贴附在钛片上，可清楚地观察到细胞核和细胞膜。（2）经细胞计数，可以计算出两种细胞与钛片的贴附数量，2型糖尿病人牙槽骨成骨细胞较正常人少，二者有统计学意义（P㩳0.05）。（3）2型糖尿病人牙槽骨成骨细胞加入两种微球后，经细胞计数，加入rhIGF-1微球的糖尿病人成骨细胞数较加入安慰剂微球的糖尿病人成骨细胞数多，二者存在统计学意义（P㩳0.05），证实了PLGA包裹的rhIGF-1微球对2型糖尿病人牙槽骨成骨细胞的诱导分化作用。研究结论：（1）2型糖尿病病人牙槽骨成骨细胞可以在体外成功培养，虽有正常成骨细胞的形态和生物学特性，但细胞生长缓慢，特征性分泌物含量仍较正常成骨细胞低。（2）制备的微球其大小、包封率及释放能力均较为理想，且有良好的生物相容性，可以作为促进成骨细胞分化的良好控释系统。（3）证实了PLGA是一种理想的载体，与细胞无任何不良反应。PLGA包裹的rhIGF-1微球对2型糖尿病人牙槽骨成骨细胞的诱导分化作用，为临床提高2型糖尿病患者种植体植入获得良好骨结合提供了有效手段。
【图文】：

示意图,骨改建,过程,示意图

的蛋白酶消化骨基质, 最后形成骨陷窝；成骨过程为成骨细胞移行于被吸收部位, 分泌骨基质, 最后骨基质矿化形成新骨。破骨和成骨的这种平衡是保持正常骨量的关键（如图4）。而其中的生物矿化，是不同类型的组织、细胞、细胞器和活质分子共同参与协调的一种代谢过程，在矿化过程中，骨髓细胞被分离、培养和诱导分化为软骨细胞或成骨细胞。图4：骨改建过程示意图[59]3. 成骨细胞骨形成过程主要经历四个阶段：第一阶段：成骨细胞的增值期即成骨细胞数量的增长期，其间形成多层细胞，合成分泌COL-1，最终矿化形成钙结节。I型胶原构成骨组织蛋白框架，其合成与分解是骨形成与吸收的生物学特性指标。与增值有关的基因有c-myc、c-fos、c-jun、H4组蛋白等[55,60]。第二阶段：细胞外基质成熟分化期，在增值晚期，与其相关的基因表达开始下降

示意图,示意图,IGF结合蛋白,IGF受体

这些被激活的受体发生信号通路，最终调节一系列的生物应答反应。2型IGF受体（IGF-2R）和高亲和性的IGF结合蛋白家族（IGFBPs）调节着IGF-1、IGF-2结合到受体的活性(如图5)。这些组成成分控制和决定着许多生物学效应，包括细胞的生长、增值、分化、凋亡和迁移[67、68]。IGF-1是一种单链的碱性多肽，由70个氨基酸和三个二硫键组成[69、70]，分子量为7.646kD，等电点为pH8.6。当脑垂体前叶分泌生长激素，在数分钟之内，即可促进肝细胞合成分泌为IGF-1，因此IGF-1主要由肝脏作为内分泌激素产生[71];有一少部分由成骨细胞或软骨细胞作为旁分泌产生[72]，分子结构类似于胰岛素
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R587.1;R782.2

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