Wnt5a基因敲除小鼠腭裂发生的机制研究

发布时间：2020-04-02 21:12

【摘要】： 腭裂是一种常见的先天性畸形,因其影响因素十分复杂,发生机制目前仍未明确。近年来一些研究表明,腭中嵴上皮细胞(MEE)、腭突间充质细胞(EPM)以及舌体细胞的增殖和凋亡对腭的正常发育具有重要作用,与腭裂的形成密切相关。Wnt5a是Wnt信号分子家族中唯一在上皮和间充质中均有表达的成员,并且经由Wnt/Ca2+信号通路在胚胎的发育过程中起到调控作用。以往的研究证实Wnt5a基因敲除小鼠全部外向型生长的组织,包括上下颌骨、四肢、尾以及生殖器等均发育不良,并且存在初级胚胎A-P体轴延展不足。其机制主要是Wnt5a基因敲除导致进展区细胞增殖水平的下降。目前,国内外尚没有文献报道Wnt家族成员的Wnt5a基因敲除小鼠口腔颌面部尤其是腭部的发育异常。 本实验对Wnt5a基因敲除小鼠胚胎颌面部进行冠状面连续切片,观察其继发腭的形态;利用BrdU标识法和TUNEL染色,研究侧腭突细胞以及舌体细胞在腭突融合期的细胞增殖和凋亡水平,来探索Wnt5a基因敲除小鼠腭裂发生的机制。 目的:本课题应用Wnt5a基因敲除小鼠,通过观察细胞增殖和细胞凋亡在腭部发育和腭裂发生中表达水平和分布的改变,探究Wnt5a信号分子对颌面部尤其是腭部发育的调控机制。 方法:本实验应用的Wnt5a基因敲除杂合子成鼠由美国Harvard大学的Dr. McMahon实验室赠予,饲养在美国南加州大学Keck医学院动物中心,将阴栓阳性的孕鼠记为妊娠0天(gestation day 0,GD0)全部孕鼠分别于GD14、GD15和GD18上午10时处死,处死前20分钟均按100mg/kg体重腹腔注射BrdU。分离Wnt5a基因敲除和正常对照鼠胚,4%多聚甲醛固定,系列脱水,包埋,5μm冠状面连续切片用于HE染色、BrdU标识和TUNEL标记。 结果:与正常对照组相比,Wnt5a基因敲除小鼠胚胎表现如下:1、口腔颌面部形态学上的明显异常,主要为上下颌短缩、舌异常隆起并且未能下降、侧腭突短缩并缺乏水平上抬而形成腭裂。2、BrdU染色结果显示腭突融合期的腭间充质细胞以及舌上皮与间充质细胞阳性细胞数和阳性细胞率与正常对照组相比无显著性差异,而在腭正中嵴上皮却未发现阳性细胞。3、TUNEL标识法结果显示腭突间充质细胞、舌背上皮细胞及舌体间充质细胞发生异常增多的TUNEL阳性的凋亡细胞,而在腭正中嵴上皮却未发现TUNEL阳性细胞。 结论:1、Wnt5a基因敲除小鼠口腔颌面部发育异常,主要表现为腭裂和舌形态及位置异常。2、Wnt5a基因敲除小鼠腭裂发生与腭正中嵴上皮细胞的增殖和凋亡水平改变以及腭突间充质细胞凋亡水平改变具有相关性;同时舌形态及位置异常也是其腭裂发生的重要影响因素。
【图文】：

光学显微镜观察 Wnt5a 基因敲除小鼠胚胎口腔颌面部冠14.5、HE 染色）对照组：舌体表面已经转变至扁平，并且下降至相当于前腭突生长良好（A）；侧腭突前 1/3 部（下颌第一磨牙照）的双侧侧腭突已经上抬至舌体上方，并且在中线处可见少量残余 MEE 细胞，左右两侧腭突的 EPM 细胞已（B）；侧腭突后 1/3 部（上颌第一磨牙牙胚作为平面参突处于接触融合的初期，中线处可见若干残留 MEE 细胞验组：舌体形态依旧处于高而窄的状态，舌表面凹凸不稍有下降，但依然占据了固有口腔的大部分空间。前腭常（D）；侧腭突前 1/3 部的左右两侧腭突已上抬至舌的行水平方向的生长，但是没有发生接触，即该部位发生E）；侧腭突后 1/3 部的左右两侧腭突在舌的两侧进行垂裂隙的距离大于侧腭突前部（F）。（A、B、C 为正常对照

光学显微镜观察 BrdU 阳性细胞在口腔颌面部的表达分布U 阳性细胞表现为胞核的褐色染色。低倍视野可见阳性细颌、下颌、牙胚、腭突以及舌组织(A、D)；Wnt5a 基因以及侧腭突间充质的 BrdU 阳性细胞数量以及占总细胞组相比无显著差异（B、E）。正常对照组侧腭突融合，皮细胞仍可见 BrdU 阳性细胞（C）；Wnt5a 基因敲除小发生接触融合，其正中嵴上皮细胞已由复层转化为单层胞核明显，但未见 BrdU 阳性细胞（F）。（A、B、C 为正E、F 为基因敲除组；A、D 为 25 倍放大，，B、E 为 100 200 倍放大； T 为舌； D 为牙胚； P 为侧腭突；黑色箭头 MEE 中 BrdU 阳性细胞；红色箭头所指为基因敲除小平状细胞）
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R782.2

【共引文献】

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本文编号：2612448