Dlx3对人牙髓细胞增殖分化的影响及其分子机制研究

发布时间：2020-04-06 04:31

【摘要】：牙髓细胞是来源于神经嵴和间充质的多潜能细胞,主要由成牙本质细胞,成纤维细胞及未分化的间叶细胞组成,牙髓细胞是牙本质形成的关键。成牙本质细胞的增殖分化是牙胚发育和牙髓组织自我修复的关键。这一过程受多种基因和信号分子的调控。Dlx3为Dlx家族成员,位于17q21.33,在脊椎动物体内广泛表达,参与表皮及外胚层附属器官如腺体、牙齿、毛囊的发育。在牙齿发育过程中,Dlx3首先表达于牙源性上皮,在此成釉细胞分化为牙釉质,之后表达于牙源性上皮和间充质。之前的一些研究表明Dlx3参与成骨细胞的增殖分化,在软骨内骨化过程中,Dlx3在干骺端端的软骨区、分化中的成骨细胞、分化完成的成骨细胞中表达升高。在成骨细胞内高表达Dlx3,可以显著上调成骨细胞分化的标记物。 成骨细胞和成牙本质细胞都来源于间充质细胞,具有相似的生物学行为,因此,我们推测Dlx3可能会在牙齿发育过程中影响牙髓细胞的增殖和分化。 本课题研究的目的是观察Dlx3在调控牙髓细胞增殖及其向成牙本质细胞方向分化中的作用,探讨Dlx3在人牙髓细胞增殖的作用机制。本研究包含两个部分： 第一部分：DI×3在人牙髓细胞增殖及其向成牙本质分化中的作用 1DI×3在人牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的表达 从新鲜拔除的正畸前磨牙获取人牙髓细胞,矿化诱导液培养。Real-time、 Western blot检测矿化过程中转录因子Dlx3及矿化相关因子DSPP的表达情况。结果：在矿化诱导液的作用下,细胞内Dlx3表达量逐渐升高,Dlx3表达趋势与DSPP表达趋势一致。结论：Dlx3在牙髓细胞的表达随着分化程度而上升。 2DI×3稳定感染细胞建立 通过PCR扩增质粒获得Dlx3基因及启动子CMV,用HpaI、XhoI双酶切后将目的片段CMV+Dlx3连接到慢病毒载体pLL3.7质粒上,构建慢病毒表达质粒h-Dlx3-pLL3.7。h-Dlx3-pLL3.7或pLL3.7与psPAX2, pMD2.G起共同转染293FT获得病毒液,感染人牙髓细胞,得到稳定高表达Dlx3或pLL3.7的细胞hDPC/Dlx3、 hDPC/pLL3.7。hDPC/Dlx3可同时表达GFP和Dlx3。荧光显微镜和流式细胞仪观察感染效率,Real-time、Western blot检测hDPC/Dlx3组Dlx3表达情况。结果：荧光显微镜下观察GFP在0-14天都有较高的表达,流式细胞仪结果显示超过90%的细胞表达GFP. hDPC/Dlx3组Dlx3mRNA和蛋白的表达都较对照组hDPC/wt及hDPC/PLL3.7显著性升高。结论：成功构建了稳定表达Dlx3的细胞群。 3DI×3对牙髓细胞增殖活性的影响 迎过直接细胞计数和EdU检测Dlx3对人牙髓细胞增殖能力的影响。结果：直接细胞计数表明Dlx3感染的牙髓细胞增殖能力下降,而hDPC/wt、hDPC/pLL3.7两组增殖能力相似。EdU检测同样显示hDPC/Dlx3组EdU阳性细胞较对照组hDPC/wt、hDPC/pLL3.7,对照两纽EdU阳性细胞率无统计学差异。结论：Dlx3抑制牙髓细胞的增殖。 4Dlx3对牙髓细胞分化的影响 为了研究Dlx3在牙髓细胞向成牙本质细胞分化过程中的作用,我们检测了矿化结节形成,碱性磷酸酶活性,矿化相关基因DSPP、DMP1、ALP、Nestin及牙本质特异性蛋白DSP、DMP1的表达。结果：体外连续矿化诱导培养28天,Von Kossa染色后相差显微镜下观察矿化结节的形成发现hDPC/Dlx3组矿化结节数量和面积均大于hDPCs/pLL3.7、hDPCs/wt。碱性磷酸酶的活性也较对照组有显著升高。Real-time结果显示,矿化相关基因DSPP、DMP1、ALP、Nestin在第14天在hDPC/Dlx3组的表达均高于对照组,其中ALP表达提高最显著,较对照组高15倍,DSPP、DMP1、Nestin较对照组高1.9-3倍。DSP、DMP1蛋白在hDPC/Dlx3组的表达均高于对照组,与DSPP、DMP1mRNA表达一致。结论：Dlx3通过上调矿化相关基因促进牙髓细胞向成牙本质方向分化。 第二部分：DIx3抑制牙髓细胞增殖的分子机制研究 1DKK抑制牙髓细胞增殖由DKK1介导 免疫荧光确定DKK1、Dlx3在人牙髓细胞中的表达,Real-time检测Dlx3高表达对DKK1mRNA的影响,使用DKK1siRNA抑制内源性DKK1表达后,观察是否可减弱Dlx3对牙髓细胞增殖的抑制作用。结果：Dlx3、DKK1都在人牙髓细胞中有表达,Dlx3高表达能促进DKK1基因的表达,同时下调Wnt/β-actin通路靶基因c-myc及clyclin D1的表达,siRNA沉默DKK1减弱Dlx3对牙髓细胞的增殖的抑制作用。结论：Dlx3抑制牙髓细胞增殖由DKK1介导。 2DKK1基因启动子序列中DI×3结合位点的预测 使用Genebank数据库查找人DKK1基因5’侧翼区-2000～+389区域DNA序列,手工检索Dlx3结合位点TAATT/AATTA,探测转录因子在基因调控区域的结合位点。然后通过构建含有不同长度DKK1基因启动子片段的重组报告质粒进行双荧光素酶检测,比较其活性变化从而确定转录调控区。结果：在DKK1启动子上游2000bp区域发现了12个Dlx3潜在结合位点。一系列荧光素酶表达载体瞬时转染293细胞后,分析这些表达载体荧光素酶表达活性发现DKK1的转录调控关键元件位于转录起始点上游-1656to-1245区域。结论：Dlx3对DKK1基因有启动活性。 3DI×3与DKK1基因启动子结合的体内研究 通过染色体免疫沉淀技术(CHIP)研究转录因子Dlx3在体内是否可以与DKK1基因启动子结合,用anti-Dlx3抗体沉淀染色体DNA,人IgG抗体做对照,PCR分析沉淀结果。结果：在体内,Dlx3可以结合到DKK1基因启动子上游1656bp至1245bp区域。结论：Dlx3在体内能够和DKK1基因启动子1656bp至1245bp区域结合。 4DI×3对结合位点缺失型p1656载体的调控研究 通过基因定点突变技术构建Dlx3结合位点缺失型p1656载体,研究DKK1基因启动子上Dlx3结合位点缺失后,Dlx3对DKK1转录活性的影响,以证实Dlx3确实是通过这些特定结合位点增强DKK1基因的转录活性。结果：突变Dlx3结合位点I或II对荧光素酶活性没有显著的影响,突变Ⅱ或Ⅲ显著降低荧光素酶活性。结论Dlx3通过D1x3II和Dlx3Ⅲ两个位点影响DKK1转录活性。
【图文】：

图2.1pLL3.7质粒图谱Fig 2.1 map of pLL3.7有关试剂的配制培养基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母浸提物、l%Nacl)l双蒸水中加蛋白胨lO.Og、酵母浸提物5g、Nad lO.Og。振荡使之入双蒸水水定容1000ml。高压灭菌，4°C储存。选择性LB培养基在素至其终浓度lOOug/ml。培养基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母浸提物、l%Nacl、1.5%琼脂粉ml双蒸水中加蛋白胨2.0g、酵母浸提物l.Og、Nacl2.0g、琼脂粉3.0完全溶解，加入双蒸水水定容2()0ml。高压灭菌，待冷却至5(rC加终浓度lOOug/ml。按20ml/皿将液体倒入90mrn平皿，置室温凝固后，。霉素（lOmg/ml，lOOx)霉素（Ig)溶于100ml无菌超纯水中，0.22胖滤器过滤，分装储存

小约1200bp的目的片断，与预期片断大小一致。证明PCR法成功的从菌落中扩增出 Dlx3+CMV prom。（图2.4)2.3.1.2. h-Dl)f3-pLL3. 7质粒经PstI、Xhol 双酵切及Hindlll 单酵切结果h-Dlx3-pLL3.7质粒经PstI、Xhol酶切、Hindlll单酶切电泳后片断大小正确，证明Dlx3己经进入载体pLL3.7中。（图2.4)2. 3. 1. 3 h-Dlx3-pLL3. 7质粒的测序对该重组质粒h-Dlx3-pLL3.7进行DNA测序，，测序结果正确(图2.5)2. 3. 2病毒包装2. 3. 2. 1共转染48小时后293FT细胞GFP观察重组病毒共转染48小时后，荧光倒置显微镜下观察到293FT细胞中有绿焚光，为报告基因GFP的表达，表明共转染成功。（图2.6)2. 3. 2. 2人牙趟细胞细胞被Lenti-Dlx3感染72小时后的观察37
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781

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本文编号：2616015