TGF-β信号通路抑制剂调控hGMSCs体内外成骨分化及其机制的初步研究

发布时间：2020-04-06 08:29

【摘要】：[目的]探讨转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路抑制剂SB431542,在体内外对人牙龈间充质干细胞(human gingival mesenchymal stem cells,hGMSCs)骨向分化的影响;并对该抑制剂在hGMSCs成骨过程中的作用机制进行初步探讨,为基于自体干细胞的骨缺损再生修复治疗提供新的细胞来源。[方法]组织块法分离培养hGMSCs,利用流式细胞术检测表面标志物、克隆集落形成实验及体外成骨诱导分化对hGMSCs进行鉴定;给予hGMSCs不同浓度(0、0.1、1和10μmol/L)SB435142处理,CCK-8及流式细胞仪分别检测增殖活性及凋亡比例;SB435142成骨诱导21d后,进行茜素红染色,比较矿化结节形成的能力,并用Western blot检测成骨相关蛋白Runt相关转录因子2(RUNX2)、碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白(COL-1)及骨桥蛋白(OPN)的表达;体内实验分为三组:Bio-Oss(?)组,Bio-Oss(?)/hGMSCs组及Bio-Oss(?)/hGMSCs/SB431542组,分别移植于裸鼠背部皮下,12周后取出移植物,固定脱钙后进行切片,HE及Masson染色,比较成骨效果;采用Western blot或者qRT-PCR检测SB431542诱导hGMSCs成骨过程中TGF-β及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)信号通路的变化并做验证。[结果]1.成功分离培养出hGMSCs,细胞高表达MSCs表面标志物CD44(100%±0.00%),CD73(99.99%±0.01%),CD90(100%±0.00%)和CD105(99.93%±0.03%),阴性表达造血干细胞及白细胞表面标志物CD34(0.02%±0.01%),CD45(0.00%±20.01%),CD19(0.03%±0.02%),CD11b(0.03%±0.02%),HLA-DR(0.03%±0.023%)和HLA-DQ(0.06±0.03%),且具有自我更新及成骨分化能力。2.与对照组相比,各处理浓度SB431542未引起hGMSCs凋亡率的明显改变(p0.05),而10 μmol/L SB431542作用于hGMSCs第7天时,细胞增殖能力较对照组降低(p0.05);3.1 μnol/L SB431542能显著增加hGMSCs矿化结节的形成(p0.05),且成骨相关蛋白RUNX2、ALP、COL-1及OPN的表达均明显高于对照组及空白组(p0.05);4.裸鼠皮下移植 12周后,HE及Masson染色结果显示,Bio-Oss(?)/hGMSCs/SB431542 组新生骨量明显多于 Bio-Oss(?)/hGMSCs 组及Bio-Oss(?)组(p0.05);5.在hGMSCs成骨过程中,SB431542处理组的TGF-β信号通路下游信号分子SMAD3磷酸化水平明显被抑制(p0.05),相反,BMP2及BMP4表达较对照组明显增高(p0.05),且BMP信号的抑制剂Noggin降低了SB431542诱导矿化结节的形成(p0.05)。[结论]1.TGF-β信号通路抑制剂SB431542可显著增加hGMSCs在体内外骨向分化潜能;2.SB431542提高hGMSCs的成骨分化能力,可能是通过抑制TGF-β信号通路下游分子SMAD3磷酸化水平,激活BMP信号,上调BMP2及BMP4,调控成骨相关蛋白的表达来实现的。
【图文】：

逡逑■■逡逑图２－ｌｈＧＭＳＣｓ分离培养不同时间的细胞形态（＞＜４０）邋（Ａ．原代培养０天；Ｂ．原代培养５天；逡逑Ｃ．原代培养１０天；Ｄ．第二代细胞）逡逑２．３．２逦ｈＧＭＳＣｓ克隆集落形成能力检测逡逑经过１４天培养，甲苯胺蓝染色发现ｈＧＭＳＣｓ形成一定数量的克隆，提示逡逑ｈＧＭＳＣｓ具有自我更新能力（图２－２）。逡逑图２－２邋ｈＧＭＳＣｓ克隆集落（Ａ．肉眼观：Ｂ．镜下观ｘ４０）逡逑２．３．３逦ｈＧＭＳＣｓ表面标志物流式鉴定逡逑流式细胞仪鉴定结果显示，ｈＧＭＳＣｓ强阳性表达ＭＳＣｓ表面标志物逡逑ＣＤ４４（１００％±０．００％），ＣＤ７３（９９．９９％±０．０１％），ＣＤ９０（１００％±０．００％）和邋ＣＤ１０５邋（９９．９３％逡逑±０．０３％邋）。不表达造血干细胞及巨噬细胞、Ｂ细胞表面标志物ＣＤ３４逡逑（０．０２邋％±０．０１％），邋ＣＤ４５邋（０．００％±邋０．０１％），邋ＣＤ邋１９邋（０．０３％邋±０．０２％），邋ＣＤｌｌｂ逡逑（０．０３％±０．０２％），ＨＬＡ－ＤＲ（０．０３％±０．０２３％）和邋ＨＬＡ－ＤＱ（０．０６±０．０３％）（图邋２－３，逡逑图邋２－４）。逡逑ｉ［￣邋０．０４％逦｜｜逦０．０１邋％邋＇邋ｉＨ￣０．０４％逦Ｓ逦ｕｊｐ％邋Ｉ逦｜｜逦0％￣逡逑Ｐ邋＾邋．邋：邋ＩＩ邋，逦，邋Ｐ邋．邋Ｉ；邋Ｉ邋ｉｆ邋，逡逑■」逦ｉＪ邋ｉｌ逦ｓ逦Ｊｌ逦ｉ」逡逑■Ｗ２邋0ＣｄＳ邋ＦＴｒＩ？－Ａ邋１（１逦１４５0ＣＤｌ１°ｂＦｆＴＣ－Ａ，０逦。’、９１。％丨１＾、〗。逦＾４１？邋°邋ＣＤ４５邋ＦＩＴＣ－Ａ，0逡逑９逡逑

２．３．２逦ｈＧＭＳＣｓ克隆集落形成能力检测逡逑经过１４天培养，甲苯胺蓝染色发现ｈＧＭＳＣｓ形成一定数量的克隆，提示逡逑ｈＧＭＳＣｓ具有自我更新能力（图２－２）。逡逑图２－２邋ｈＧＭＳＣｓ克隆集落（Ａ．肉眼观：Ｂ．镜下观ｘ４０）逡逑２．３．３逦ｈＧＭＳＣｓ表面标志物流式鉴定逡逑流式细胞仪鉴定结果显示，ｈＧＭＳＣｓ强阳性表达ＭＳＣｓ表面标志物逡逑ＣＤ４４（１００％±０．００％），ＣＤ７３（９９．９９％±０．０１％），ＣＤ９０（１００％±０．００％）和邋ＣＤ１０５邋（９９．９３％逡逑±０．０３％邋）。不表达造血干细胞及巨噬细胞、Ｂ细胞表面标志物ＣＤ３４逡逑（０．０２邋％±０．０１％），邋ＣＤ４５邋（０．００％±邋０．０１％），邋ＣＤ邋１９邋（０．０３％邋±０．０２％），邋ＣＤｌｌｂ逡逑（０．０３％±０．０２％），ＨＬＡ－ＤＲ（０．０３％±０．０２３％）和邋ＨＬＡ－ＤＱ（０．０６±０．０３％）（图邋２－３，逡逑图邋２－４）。逡逑ｉ［￣邋０．０４％逦｜｜逦０．０１邋％邋＇邋ｉＨ￣０．０４％逦Ｓ逦ｕｊｐ％邋Ｉ逦｜｜逦0％￣逡逑Ｐ邋＾邋．邋：邋ＩＩ邋，逦，，邋Ｐ邋．邋Ｉ；邋Ｉ邋ｉｆ邋，逡逑■」逦ｉＪ邋ｉｌ逦ｓ逦Ｊｌ逦ｉ」逡逑■Ｗ２邋0ＣｄＳ邋ＦＴｒＩ？－Ａ邋１（１逦１４５0ＣＤｌ１°ｂＦｆＴＣ－Ａ，０逦。’、９１。％丨１＾、〗。逦＾４１？邋°邋ＣＤ４
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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本文编号：2616270