Pg-LPS对人牙周膜细胞共培养下的人脐动脉平滑肌细胞钙化能力的影响
发布时间：2020-04-07 06:30
【摘要】：目的:牙周炎是心血管疾病的独立危险因素,牙周感染会增加血管钙化的风险。牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)可促进大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs)的异常增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性,对相关钙化基因ALP、核心结合因子αl(Cbfαl)、骨涎蛋白(BSP)和骨桥蛋白(OPN)均具有促表达作用。但体内环境复杂,Pg-LPS在体内情况下对VSMCs的作用尚待研究。利用Transwell小室建立的两种细胞的共培养模型可以更好地模拟体内微环境,本实验利用Transwell小室建立体外人牙周膜细胞(HPDLCs)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMCs)共培养系统,初步探究Pg-LPS刺激时,对HPDLCs共培养条件下的HUASMCs增殖和ALP活性以及对其相关钙化基因mRNA(ALP、Cbfαl、BSP)表达的影响。方法:1.细胞培养:采用I型胶原酶+组织块法获得原代HPDLCs,HUASMCs原代购自美国ScienceCell公司,传代培养并鉴定HPDLCs和HUASMCs;利用Transwell小室建立HPDLCs-HUASMCs体外共培养系统。2.CCK-8法检测HUASMCs增殖:实验分4组以及各组处理情况:C组(单独正常培养 HUASMCs);C-P 组(HUASMCs+Pg-LPS);CO 组(HPDLCs-HUASMCs共培养)和CO-P组(HPDLCs-HUASMCs共培养+Pg-LPS)。实验所加Pg-LPS的浓度均为lμg/ml。各组细胞均培养48h后,采用CCK-8法和碱性磷酸酶试剂盒分别测定各组中HUASMCs的增殖和其ALP的活性。3.钙化诱导茜素红S染色及钙化结节定量分析:采用Pg-LPS和含维生素C、地塞米松、β-甘油磷酸钠的钙化诱导液诱导HUASMCs成骨分化。实验分8组以及各组处理情况:C组(单独正常培养HUASMCs);C-P组(单独培养HUASMCs+Pg-LPS);C-C组(单独培养HUASMCs钙化诱导);C-CP组(单独培养HUASMCs钙化诱导 + Pg-LPS);CO 组(HPDLCs-HUASMCs 共培养)；CO-P 组(HPDLCs-HUASMCs 共培养+Pg-LPS);CO-C 组(HUASMCs-PDLCs 共培养钙化诱导)和 CO-CP组(HUASMCs-PDLCs共培养钙化诱导+Pg-LPS)。作用21 d后使用茜素红S染钙化结节,并定量检测钙化结节。4.RealTimePCR检测钙化相关因子(ALP、Cbfαl、BSP等)的表达:实验分组及各组处理情况同方法3,培养48h后,采用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测Pg-LPS对各组HUASMCs中成骨分化相关基因ALP、Cbfαl和BSPmRNA表达的影响。结果:1.细胞培养:采用Ⅰ型胶原酶+组织块法成功培养出HPDLCs,并成功建立HPDLCs-HUASMCs共培养系统。2.HUASMCs的增殖:C-P组和CO-P组中HUASMCs的增殖和ALP活性分别强于C组和CO组;且共培养的CO-P组中HUASMCs的增殖和ALP活性强于单独培养的C-P组。3.茜素红S染色和结节定量结果表明:钙化诱导各组较普通培养各组钙化结节明显增多;且在不同培养条件下,Pg-LPS均促进钙化结节的形成;而共培养的CO-C组和CO-CP组钙化能力分别强于单独培养的C-C组和C-CP组。4.RT-PCR结果示:Cbfαl、ALP、BSP在钙化诱导组的表达分别明显高于普通培养组的;在含Pg-LPS的各组的表达显著高于不含Pg-LPS的各组;Pg-LPS或钙化诱导液以及两者同时存在的时候,共培养各组的钙化能力分别高于单独培养的各组。结论:Pg-LPS可能通过促进HUASMCs增殖增强、ALP活性和上调钙化相关基因(ALP、Cbfαl、BSP)的表达进而影响其钙化;且与HPDLCs共培养条件下对HUASMCs的钙化作用更强;提示牙周炎可能比单纯的炎症更能促进血管钙化的发生发展,牙周炎对心血管疾病的发生发展有一定的促进作用。
【图文】：
１邋ＨＰＤＬＣｓ的原代及传代培养逡逑用组织块＋酶消化法揞养ＨＰＤＬＣｓ，约３－５夭可见有细胞从组织块边缘游出，细逡逑胞数量逐渐X椂嘀磷橹橹芪Ы洗蟮纳ぴ位蛄映善笨山写ㄍ迹玻保粒桢义瞎庋晕⒕迪鹿鄄欤杉赴食に笮位蛐切危派渥磁帕校嗽残位蛲衷残危义现史崧⒕龋氏殖龀上宋赴男翁ㄍ迹玻保拢╁义希礤义贤迹玻卞澹龋校模蹋茫蟮脑按嘌埃矗埃义希ǎ粒号嘌诽旌螅澹龋校模蹋茫蟠幼橹楸咴涤纬觯唬拢捍嘌冢炒模龋校模蹋茫蟪食に笮五义匣蛐切危派渥磁帕校╁义希保插义，
本文编号：2617565
【图文】：
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