剪切力作用下（类）成骨细胞LEF-1的表达

发布时间：2020-04-08 06:22

【摘要】：研究背景及目的:力学刺激是细胞在生物进化过程中受到的最基本的生物刺激之一,适当的机械力学刺激可以促进细胞的生长分化.体内实验及临床应用发现适宜的力学加载在骨折修复、正畸牙移动以及牵张成骨(颌骨发育不足的矫治、骨缺损的整复、肢体延长)等治疗中,能刺激骨组织自身生长与重建。同时大量体外实验也表明,适当的应力载荷可以促进骨形成性蛋白及其受体,胶原蛋白、OPN、VEGF等的表达,诱导成骨细胞自身的分化增殖,调节其生理功能,有助于细胞基质矿化与骨重建.研究类成骨细胞及成骨前体细胞的力学信号转导及骨细胞的生物学响应对于口腔正畸,正颌外科,口腔种植修复,牙槽骨再生,种子细胞工程学具有重要意义,但目前机械应力刺激成骨细胞的力学信号转导机制及成骨细胞在力学环境中的生物学响应有待于继续深入. Wnt信号通路通过调节成骨细胞的增殖、分化和功能来影响个体出生后的骨组织生长和发育。上调或下调这条途径中各个因子的表达能够明显的改变成骨细胞的功能,并改变整个骨量的变化。淋巴样增强因子-1(1ymphoid enhancer factor-l,LEF-1)是淋巴增强因子/T-细胞因子(LEF/TCF)家族的成员之一,位于人4号染色体q23-q25区域,作为一个重要的转录因子是Wnt信号通路的核心成分,属于高迁移率组分(high mobility group,HMG)。研究显示LEF-1参与Wnt信号通路,IL-7受体信号通路、TGF-β信号通路等多条信号通路的调控,具有复杂性及多启动子特征,多结构域,多异构体的特点。LEF-1蛋白异常已在一些牙胚发育,骨组织发育,口腔恶性肿瘤如恶性黑色素瘤细胞中发现并引起重视,关于其在各种属成骨(类)细胞接受机械力学刺激后的表达,目前国内外尚未见报道,通过国内外核心期刊的文献检索,反映Wnt通路的上游研究包括目的基因的识别传递,膜受体的结合,介质在胞浆的传递和转移等方面涉及的研究较多,但靶基因结合后效应阶段的研究尚处于起步阶段.骨髓间充质干细胞或骨祖干细胞不表达典型的成骨标志基因,循环牵张力诱导转录因子FosB表达成骨标志基因[1],并激活Wnt信号途径促进细胞内的力敏感基因表达[2].前成骨细胞在基因Osx的调控下,分化为典型的成骨细胞,然后分化成熟,合成和分泌细胞外基质,包括成熟早期的骨涎蛋白,中期的骨钙素和晚期的骨桥蛋白[3-4].基于以上实验基础,本实验采用力学加载装置对来源于不同种属的成骨前体细胞:大鼠来源的骨髓间充质干细胞(Marrow Mesenchymal Stem Cells,MSCs ),人牙周膜细胞( human periodontal ligament cells,hPDLC ) ,小鼠来源的MC3T3-E1成骨样细胞系进行横向研究,从细胞的基因水平和蛋白水平通过细胞受力前后LEF-1的表达改变,初步探讨三种类成骨细胞在机械应力作用下LEF-1的表达,下游靶效应机制以及牵张力对细胞分化增殖特性的影响,从Wnt信号通路角度探索LEF-1的生物学功能和机械应力对于诱导骨转化形成的分子生物学机制. 材料与方法: 1骨髓间充质干细胞(BMSCs)的原代培养全骨髓贴壁法培养大鼠BMSCs.处死大鼠后将大鼠双侧股骨和胫骨骨骺端剪去,PBS反复冲洗骨髓腔,收集冲洗液于离心管中,离心弃上清,加入培养液后吹打形成单细胞悬液,接种于培养瓶内,常规换液传代. 2人牙周膜细胞的原代培养收集临床上11-14岁因正畸需要拔除的牙周健康无龋的新鲜前磨牙,拔除后立即在双抗PBS液和DMEM液中反复清洗牙齿,刮下根中1/3牙周膜组织,不经剪切,直接置于离心管中,加入Ⅰ型胶原酶,采用酶消化法结合组织块混合培养法培养hPDLC.取第二代细胞经SABC免疫细胞化学检测证实为牙周膜成纤维细胞. 3 MC3T3-E1细胞培养小鼠胚胎成骨细胞系MC3T3-E1细胞复苏后用DMEM培养液培养(内含10% FBS),每3天换液1次,细胞达80%融合时,用0.25%胰酶消化,按5×105个细胞接种至25 cm培养瓶中传代培养。 4反转录聚合酶链反应检测加力前后三种(类)成骨细胞LEF-1的表达 1)引物设计与合成; 2)细胞总DNA的提取及逆转录; 3)将总DNA逆转录为cDNA; 4)将cDNA产物进行PCR扩增后,电泳检测PCR扩增物:PCR反应结束后,在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳,使用DL-2000 DNA Marker,所得结果拍照并扫描. 5免疫荧光双标记加力完毕后用4%多聚甲醛固定, 0. 2% TritonX 100透化去交联,其间2%牛血清白蛋白封闭非特异性位点。每张爬片加入30μ12%牛血清白蛋白(BSA)稀释的非磷酸化β-catenin多克隆抗体(1∶100) ,放入湿盒1h ,避光下加入30μl2% BSA稀释的RBITC标记山羊抗兔二抗(1∶150) ,放入湿盒1h。DAPI作用5 min ,将玻片反扣于新玻片,中间加MOVO(荧光淬灭剂) 10 ml,95%甘油封片。荧光倒置显微镜下分别在495 nm,527 nm激发光下观察同一视野中的表达情况并摄像。上述实验重复3次。每个水平每张照片选取3个不同的视野,每个视野50个细胞,用Image2pro2plus图像分析软件分析各个水平蛋白表达的积分光密度值(IOD). 6 ALP染色将细胞以1×10~8/ml接种于玻片→PBS清洗盖玻片3次→10%甲醛溶液中固定30min→蒸馏水漂洗5 min→放入孵育液、37℃孵育2h→蒸馏水漂洗5min→2%硝酸钻液作用2min→蒸馏水漂洗5min→2%硫化胺液作用2min→蒸馏水漂洗多余的硫化胺染液,待干→2%美蓝复染→树胶封存后置于光学显微镜观察。 7统计学分析用Bandscan5.0对结果进行灰度值分析.以样品的LEF-1的灰度值与同一样品GAPDH的灰度值之比作为评价LEF-1的指标.(t检验) 结果 RT-PCR检测表明,来源于不同种属的细胞MSCs细胞,hPDLC细胞,MC3T3细胞内存在LEF-1 mRNA表达;在FSS作用下LEF-1 mRNA表达水平的升高具有规律性,但存在一定差异. 在人牙周膜细胞组,对照组LEF-1 mRNA表达微弱。加力2h,4h后,LEF-1 mRNA表达水平呈升高趋势,加力8h LEF-1 mRNA表达水平升高至峰值,12h LEF-1 mRNA表达水平开始下降,但仍高于对照组;在MSCs细胞组对照组和2h LEF-1 mRNA表达微弱,4h组未见表达,8h组LEF-1 mRNA表达水平升高至峰值;在MC3T3-E1细胞组,对照组和2h组的LEF-1 mRNA有较弱表达,半小时和4h组LEF-1 mRNA表达下降,持续12dyn/cm 8h组的LEF-1 mRNA表达水平升高至峰值. 结论本实验发现LEF-1 mRNA在正常人牙周膜细胞的表达(未见报告).在FSS作用的12 h内,MSCs细胞,hPDLC细胞,MC3T3细胞内的LEF-1 mRNA表达呈波动增强趋势,且在不同大小的FSS力值,不同种属来源前提下均于8h到达LEF-1 mRNA表达峰值,该结果表明剪切应力增强LEF-1的表达,我们认为LEF-1 mRNA的表达增强是类成骨细胞经典Wnt信号通路对剪切应力的应答反应. LEF-1蛋白的低表达是成骨细胞成熟的必要条件.LEF-1的表达未见种属差异.
【图文】：

大鼠,细胞,贴壁细胞

本实验梯度离心结果为:从上到下依次为血小板层,白膜层,Percoll,红细胞层.其中白膜层为 MSCs 层,是一个单个核细胞层.结合利用SCs 的贴壁生长特性,弃去未贴壁细胞,获得比例更大,均一性更高的大 MSCs.倒置显微镜下观察: 48-72h 贴壁细胞多数呈纤维状,换液除去未贴细胞.接种 5-7 天形成集落,14 天达到融合 85%.传代培养后观察:均匀布生长,细胞绝大部分呈长梭形,少数为三角形,胞核呈圆形或椭圆形,于细胞中央,为蓝色,可见数个深蓝色的核仁,胞浆为淡红色,染色质疏.鉴定:本实验应用免疫组化方法检测了大鼠 MSCs 的 4 种表面抗原的达情况.结果显示:CD34(造血干细胞标记物)阴性,排除了细胞是造血细胞的可能;CD44 阳性,ColagenⅠ阴性,Fibronectin 阳性说明了培养大鼠细胞是 MSCs.(图 1,2)

【参考文献】