去势大鼠骨髓基质干细胞增殖及其成骨成脂分化的研究

发布时间：2020-04-12 05:03

【摘要】： 绝经后妇女骨质疏松发展迅速,与机体雌激素缺乏有关。研究表明雌激素在骨吸收与改建中发挥了极其重要的作用,雌激素缺乏可以引起全身骨质疏松。已有实验证实[1],动物的年龄增长可导致骨髓基质细胞中骨祖细胞数量减少,这是骨质疏松症的重要原因之一,但绝经后女性骨量减少同时常伴有骨髓中脂肪组织增多的分子机制尚未明了[2]。也有实验证明[3]。体外培养的BMSCs在一定浓度雌激素的作用下,增殖能力增强,成骨能力增强,成脂能力减弱。但体外培养BMSCs和体内生长的BMSCs情况不同。是否去势后大鼠BMSCs的自身特性已发生改变,这有待证实。 本实验对去势大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)进行分离培养,利用BMSCs的多向分化培养及流式细胞仪分析对去势大鼠BMSCs进行鉴定,倒置相差显微镜观察细胞增殖情况,MTT法测量两组BMSCs增殖能力鉴定,同时用PCR的方法检测去势大鼠骨髓基质干细胞成骨、成脂基因,进而研究去势后大鼠骨髓基质干细胞增殖特性、成骨成脂能力的变化。为研究骨质疏松症的机制奠定基础,进一步探讨正畸过程中骨组织改建的机制。 实验分三部分: 1、大鼠骨质疏松模型的建立 目的:用大鼠建立骨质疏松动物模型。方法:3月龄雌性SD大鼠12只,体重约300g。按体重随机分为实验组(去势组)和对照组(假手术组),1 %戊巴比妥钠(30 mg/ kg)行腹腔内注射麻醉,用双能X线骨密度仪及所附的小动物骨密度测试软件测量其整体股骨骨矿物质密度(bone mineraldensity,BMD),在无菌条件下实验组经双侧腰背部切口切除双侧卵巢,对照组以相同切口切除卵巢周围少量脂肪组织。3月后测量大鼠体重,并颈椎脱臼法处死,无菌操作下完整取出两组大鼠双侧后肢股骨,剔尽周围软组织后一侧股骨按上述方法再次测量其整体股骨BMD,另一侧留作细胞培养。结果:所有实验动物均顺利通过实验全过程,去势组大鼠体重、雌二醇及整体股骨骨矿物质密度(BMD)与假手术组比较差异有显著性( P 0. 01 )。结论:本实验成功建立了大鼠骨质疏松模型。 2、去势大鼠骨髓基质干细胞分离培养鉴定及增殖特性的变化 目的:对去势大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)进行分离培养鉴定,研究去势后大鼠BMSCs增殖特性的变化。方法:密度梯度离心分离骨质疏松大鼠的BMSCs,利用BMSCs的多向分化培养及流式细胞仪分析对去势大鼠BMSCs进行鉴定,倒置相差显微镜观察细胞增殖情况,MTT法测量两组BMSCs增殖能力。结果:诱导培养后两组大鼠BMSCs油红O染色和Von Kossa′s染色实验阳性,流式细胞仪显示骨髓基质干细胞具有的表面抗原CD29和CD44阳性而造血干细胞具有的表面抗原CD45和CD133为阴性。MTT法测定在7天内,去势组细胞的增殖速率要高于假手术组。结论:本实验分离的骨髓基质干细胞具有成骨能力和成脂能力,从而证实了本实验分离的细胞为具有多向分化潜能的BMSCs。去势后三个月大鼠BMSCs增殖能力增强。 3、去势大鼠骨髓基质干细胞其成骨成脂能力的研究 目的:通过检测去势大鼠骨髓基质干细胞成骨成脂基因的变化,研究其成骨成脂能力的变化。方法:通过RT-PCR的方法检测两组大鼠(去势组,假手术组)骨髓基质干细胞mRNA水平变化,成骨比较采用ALP(碱性磷酸酶)、BSP(骨唾液蛋白)、成脂比较采用PPARγ2(过氧化物酶体增殖物激活受体γ2)。结果:成骨诱导15d的实验组细胞BSP和ALP基因的表达量较低,成脂诱导15d的实验组细胞PPARγ2基因的表达量较高。结论:去势大鼠的成骨能力减弱,成脂能力增强。
【图文】：

第四军医大学硕士学位论文在不同时间点加入 5%MTT 20μl，4h 后再加入 150μl DMSO，振荡后酶联检测仪(490nm 波长)测光吸收值(OD 值)，以反映其对细胞增殖的影响。1.2.6 统计学方法 用 SPSS10.0 软件对数据进行统计分析，，两组间差异比较采用 t 检验。2 结果2.1 实验组和对照组大鼠 BMSCs 的形态学观察倒置显微镜观察实验组细胞分裂增殖的速率要高于对照组，取两组大鼠的第三代 BMSCs，12h 后开始有梭形或纺锤形细胞贴壁（图 4）；2d 后圆形细胞进一步减少，而梭形细胞集落增多（图 5）；3d 后逐渐成三角形或多边形生长，细胞体积变大，胞浆丰富，达 80%以上融合（图 6）。同一时间、同一光镜视野下，实验组细胞贴壁细胞数目要大于对照组。

倒置显微镜观察实验组细胞分裂增殖的速率要高于对照组，取两组大鼠的第三代 BMSCs，12h 后开始有梭形或纺锤形细胞贴壁（图 4）；2d 后圆形细胞进一步减少，而梭形细胞集落增多（图 5）；3d 后逐渐成三角形或多边形生长，细胞体积变大，胞浆丰富，达 80%以上融合（图 6）。同一时间、同一光镜视野下，实验组细胞贴壁细胞数目要大于对照组。图 4 倒置显微镜观测大鼠 BMSCs 原代培养 12h 的形态（×100）
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R78;R580

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本文编号：2624311