巴西苏木素对舌癌Tca8113细胞凋亡和自噬的影响及分子机制

发布时间：2020-04-12 19:44

【摘要】：目的探讨巴西苏木素对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其分子机制,为临床用药提供理论依据。方法用MTT法检测巴西苏木素对Tca8113细胞的增殖作用;Hoechst33342染色法观察细胞形态变化;Annexin V/PI双染色检测巴西苏木素对Tca8113细胞凋亡程度的影响;Western blot法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2、cleaved caspase3及自噬相关蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B、p62的表达;使用AMPK通路抑制剂与巴西苏木素共同作用于Tca8113细胞,并检测通路相关蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B的表达。结果 MTT结果表明,巴西苏木素能明显抑制Tca8113细胞的增殖,24 h时IC50为31.17μmol/L;Hoechst33342染色结果显示,巴西苏木素能使Tca8113细胞发生凋亡形态学改变,且与浓度正相关;Annexin V/PI染色结果显示,不同浓度巴西苏木素作用24 h后,细胞凋亡数和凋亡率均高于空白对照组;Western blot检测相关蛋白表达结果表明,巴西苏木素可抑制抗凋亡蛋白bcl-2,促进凋亡关键蛋白bax和cleaved-caspase3的表达,同时增加LC3B和p-AMPK的表达,降低p62和p-mTOR表达。在与抑制剂合用后,p-AMPK与LC3B表达量虽仍略高于空白对照组,但与单纯使用巴西苏木素相比均明显降低,而p-mTOR的表达较巴西苏木素组则明显升高(P0.05)。结论巴西苏木素能抑制Tca8113细胞增殖并促进其凋亡,同时可通过AMPK/mTOR通路诱导细胞发生自噬。
【图文】：

苏木素浓度为40μmol/L，CompoundC为5μmol/L。给药时，巴西苏木素和AMPK抑制剂组中两种药物同时给作用于Tca8113细胞。收集各组给药后24h细胞样品，用于Westernblot检测蛋白p-AMPK及p-mTOR表达。1.2.7统计学方法采用SPSS17.0对数据进行统计学分析，统计数据皆采用均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行不同组之间比较，SNK法两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1巴西苏木素抑制Tca8113细胞增殖MTT结果显示，经巴西苏木素处理后，Tca8113细胞增殖明显被抑制，且该抑制作用随药物浓度的增大而增强（图1，P<0.05）。巴西苏木素作用于Tca8113细胞24h时，半数抑制浓度（IC50）为31.17μmol/L。2.2巴西苏木素促进Tca8113细胞凋亡使用Hoechst33342染色后，荧光显微镜下观察到，空白对照组细胞形态规则，胞核完整，染色均匀，经不同*********100806040200Inhibitonrate(%)0151020304080100200Brazilin(μmol/L)图1巴西苏木素对Tca8113细胞增殖的影响Fig.1InhibitoryeffectofbrazilinatdifferentconcentrationsonproliferationofTca8113cells.*P<0.05vs0μmol/L.··352JSouthMedUniv,2019,39(3):351-356http://www.j-smu.com

浓度药物作用24h后，细胞形态及细胞核发生不同程度改变。细胞扁圆，核膜消失，染色质皱缩，胞核碎裂，部分胞核呈“新月状”和“花瓣状”，且该形态变化随药物浓度增加而更加明显（图2）。50μm50μm50μm50μmBrazilin(μmol/L)0203040图2巴西苏木素对Tca8113细胞形态学的影响Fig.2EffectofbrazilinonthemorphologyofTca8113cells(Originalmagnification:×200).通过流式细胞仪检测各组凋亡情况，结果显示：不同浓度巴西苏木素作用于Tca8113细胞24h后，细胞凋亡率随药物浓度增加而增加（图3），浓度为20、30、40μmol/L时，Tca8113细胞存活率分别为8.48%、10.26%、25.54%，均高出空白对照组7.06%。除20μmol/L外，，另外两组与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）。2.3巴西苏木素通过激活线粒体途径诱导Tca8113细胞凋亡Westernblot结果显示，与空白对照组相比，不同浓度的巴西苏木素作用24h后，凋亡相关蛋白Bax的表达量明显升高（P<0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量显著降低（P<0.05）；同时，各实验组凋亡关键蛋白cleavedcaspase3的表达水平均明显高于空白对照组的表达水平（P<0.05，图3）。3讨论巴西苏木素作为中药苏木的主要活性成分之一，其抗肿瘤作用已被广泛研究和报道，包括胶质母细胞瘤［4］、膀胱癌［6］、头颈鳞状细胞癌［7］等。研究发现，巴西苏木素能抑制舌癌细胞Tca8113细胞的增殖，促进细胞凋亡［9］，但巴西苏木素对舌癌细胞的抑制作用的具体机制尚不清楚。本实验采用MTT细胞活力检测法观察巴西苏木素0203040Brazilin(μmol/L)***0203040302520151050Apoptosisrate(%)AnnexinV-FITCPIBrazilin(μmol/L)0203040图3巴西苏?

【参考文献】

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