牙周膜成纤维细胞弹性模量与内毒素作用关系的初步研究

发布时间：2020-04-14 00:46

【摘要】：背景与目的：牙周病是指发生在牙齿支持组织（包括牙龈、牙周膜、牙槽骨、牙骨质）的慢性、非特异性、感染性疾病。其最大的危害是导致罹患牙齿的松动脱落，从而引起发音、功能和面部形态变化。人牙周膜成纤维细胞（humanperiodontal ligament cell，hPDLC）是牙周组织的主要细胞，为力学敏感细胞，在牙周组织的修复改建中起很重要的作用。活细胞具有内在的力学性质，能够响应外界环境的变化，通过改变自身的力学性质来调节相应的生物过程中的状态。细胞弹性模量是反映细胞生物力学性质的重要参数，与细胞的移动、分化、凋亡有密切的联系。内毒素是革兰阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）成分，是牙周病的重要病因之一。早期关于内毒素对牙周膜成纤维细胞的影响，多集中于内毒素刺激牙周膜成纤维细胞后细胞因子的变化，关于内毒素对hPDLC的力学性质是否产生影响，未见文献报道。本课题采用原子力显微镜初步观察牙周膜成纤维细胞经LPS作用后的弹性模量变化，以期对LPS在牙周炎的致病机理有进一步认识。方法：采用酶消化组织块法获取原代hPDLC，取第5-8代hPDLC用于实验；利用AFM接触模式对hPDLC进行扫描成像，获取hPDLC的超微结构图像；实验分为正常培养组、0.1ug/ml LPS刺激组、1ug/ml LPS刺激组、10ug/ml LPS刺激组；各实验组正常培养后加入含相应浓度LPS的细胞培养液刺激细胞24小时，采用10μm左右微球修饰的原子力显微镜探针，通过AFM获取各组hPDLC细胞核相对应区域的力曲线，借助赫兹模型计算细胞弹性模量，通过方差分析比较各组间的差异。结果：对照组、0.1μg/ml的LPS刺激组、1μg/ml的LPS刺激组、10μg/ml的LPS刺激组hPDLC弹性模量依次为1.958±0.922KPa、1.448±0.999、2.477±1.656KPa、3.654±1.926KPa。统计学分析显示,与对照组相比,0.1μg/ml的LPS刺激组细胞弹性模量明显降低,1μg/ml的LPS刺激组细胞弹性模量无明显差异,10μg/ml的LPS刺激组细胞弹性模量明显升高。各实验组相比,随着内毒素浓度的增加,细胞弹性模量逐渐升高。结论：hPDLC的弹性模量会因LPS的刺激而发生变化，提示LPS在牙周病致病机理方面可能存在新的机制。
【图文】：

图像,细胞,盖玻片

2.3.6 hPDLC 鉴定：将第四代 hPDLC 经 0.25%胰蛋白酶消化后，将细胞以 2×10/ml接种于放有 2cm×2cm 大小的盖玻片的培养皿中，常规培养，待长满盖玻片单层后取出，用 37℃PBS 冲洗 2 遍去除表面培养液，4%多聚甲醛固定细胞 20min，PBS 清洗 3 遍，采用常规 sABC 法进行波形丝蛋白、角蛋白染色，光镜下观察、照相记录。3 结果hPDLC 以组织块为中心呈放射状排列生长，一般在 7 天左右从组织块中长出，镜下观察细胞呈长梭形，胞体丰满，胞浆均匀，核圆形或暖圆形，核仁清晰（图 1a）。传代后的细胞生长旺盛，状态良好，性状稳定。细胞免疫组化鉴定结果：本组细胞角蛋白染色阴性（图 1b），波形丝蛋白染色阳性（图 1c）。表明该细胞不是上皮来源细胞，而是中胚层来源的细胞。

高分辨图像,接触模式

图 2 接触模式下 hPDLC 的 AFM 高分辨图像(80×80μm)a)形貌像：hPDLC 的相对高度图，标尺表示亮度越大该点的高度越高 b)3D 图像：hPDLC 形貌的三维图像，显示出真实空间的两细胞三维形态 c)偏转像：能够清晰的反映两细胞边缘部位，在边缘部位更加鲜明表现应力纤维的结构 d)摩擦力像：根据针尖与细胞膜接触扫描过程中的摩擦力生成的图像(图像大小为 80×80μm)Fig 2 The high resolution imaging of hPDLC in contact mode of AFMa)Topographical image: topography of hPDLC. Brightness in the bar represents the relative elevation.b)3D image :The 3D image of hPDLC, showing the three-dimensional torphology of the cell in realspace c)Deflection image:it can clearly reflect the edge area of cell and the stress fiber structured)The friction image: the image generated according to the friction between the tip and cellmembrane in the process of scanning (image size is 80 *80μm)17
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R781.4

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