以AQP5为靶点的促唾液腺分泌药物筛选及其作用机制研究

发布时间：2020-04-17 21:44

【摘要】：口干症,是主要由舍格伦综合征与激素水平下降所引起的常见疾病,具体表现为唾液流量的客观减少及唾液成分的改变。唾液功能紊乱会导致口腔功能受损,患者常常因唾液流量的降低,而造成口腔粘膜萎缩、创伤,龋齿猖撅及义齿摘戴困难等症状,对生活质量产生严重的负面影响。口干症目前缺乏特效的治疗药物,硫酸羟氯喹和雌激素仍是目前治疗口干症最常用的药物,但可能伴随严重的视网膜毒性,并增加器官损伤、感染或罹患乳腺癌的风险。由于现代医学所存在的缺陷,比如化学药物的毒副反应和手术等介入疗法给患者产生的危害和痛苦,近半个多世纪以来,医药界大力开展天然药物的研究工作,且取得了令人瞩目的成绩。一些得到科学验证的药物提取物已经得到了普遍的认可,并应用于临床研发。水通道蛋白5(aquaporin5,AQP5)是唾液腺分泌过程中重要的水通道蛋白之一,近年来已被视为是控制唾液分泌的靶分子。课题组为筛选出能够特异性促进唾液腺分泌的药物单体,建立以AQP5为靶点的药物筛选系统。我们在治疗口干症的传统中药成方的主要功能性药物单体中,选取与雌激素及与临床已有的阳性药——硫酸羟氯喹具有相似化学结构的药物单体。药物筛选范围确认后,我们利用双荧光素酶报告基因系统发现芹菜素可明显激活AQP5启动子的转录活性,并发现芹菜素的激活作用呈剂量依赖性。接下来,通过western blot实验检测不同药物单体对人唾液腺润管细胞(HSG)中AQP5表达水平的调控作用,并进一步验证了芹菜素对AQP5表达的促进作用。为探究芹菜素对AQP5的调节机制,课题组通过计算机模拟实验(Autodock)分析单体对性激素受体的结合能力,结果表明芹菜素对ERβ的结合能力明显高于ERα、AR。在转染AQP5的293T细胞中分别沉默与过表达ERα、ERβ与AR,利用双荧光素酶报告基因探究不同的性激素受体对外源性AQP5启动子转录活性的激活作用,结果发现过表达ERβ后AQP5启动子的转录活性可被明显激活。通过瞬时转染及western blot的试验方法,发现HSG在芹菜素作用条件下,过表达ERβ与沉默AR后的AQP5表达量明显提升;而过表达ERα或AR则对AQP5的表达水平影响不大。基于细胞水平的初步实验结果,我们利用摘除双侧卵巢的8周龄雌性ICR小鼠模拟绝经期口干模型小鼠,并另外选用同龄大小的雌性舍格伦综合征模型鼠,通过灌胃方法以硫酸羟氯喹、芹菜素、雌激素等药物干预12周,研究药物的体内效应及作用机制。在药物干预期间检测小鼠的体重、唾液量、饮水量,计算出各组小鼠的平均饮水量指数及唾液分泌指数并做好记录。结果表明,与ICR小鼠假手术组相比,模型组ICR小鼠的唾液分泌明显减少,饮水量增多,口干症状较为显著;而与模型组相比,芹菜素干预下的小鼠唾液分泌量增多,饮水量减少,芹菜素纠正口干症状明显。与SS模型小鼠阴对照组相比,芹菜素组SS模型小鼠能促进唾液的分泌并减少饮水量。此外,小鼠的血项检测结果显示,芹菜素能够提升小鼠的免疫细胞含量,从而提升其免疫水平。以上结果表明,芹菜素能够显著缓解小鼠由舍格伦综合征及绝经期造成的口干症状,并在一定程度上提升了自身的免疫能力。在本实验中,课题组通过以AQP5位靶点的药物筛选,发现了芹菜素可以激活AQP5启动子的转录活性,并可以促进HSG细胞中AQP5的表达;并通过对药物调控机制的探究,发现芹菜素可能通过ER β通路靶向调控AQP5的转录与表达。在动物实验中,我们验证了芹菜素可以促进小鼠唾液腺分泌并同时减少饮水的摄入,缓解小鼠由舍格伦综合征及绝经期造成的口干症状,提升免疫水平,为药物研发提供了新的方向,对临床治疗口干症的意义重大。
【图文】：

硫酸羟氯喹,单体结构,药物,化学结构

为筛选出能够特异性促进唾液腺分泌的药物单体，建立以ＡＱＰ５为靶点的药逡逑物筛选系统，我们在治疗口干症的传统中药成方的主要功能性药物单体中选择与逡逑雌激素及硫酸羟氯喹具有相似化学结构的药物单体（如图１）。逡逑白藜芦＾逦蝙蝠岛碱逦虫草素邋＞逦灵芝酸Ａ逦钩栥n逡逑°邋：Ｖ邋＾邋％邋ｖ逡逑Ｓ邋入一邋Ｓ逦，逡逑地黄苷Ｄ逦延胡索甲素逦延胡索乙素原阿片碱逡逑ｆ邋ｆ邋＆逡逑毛蕊异黄ＳＨ逦芹菜素逦大黄酚逦大黄酸逦芒枘花素逡逑松丨、ｉｃｘｖ＇ｒｒ！／１逡逑Ｄ逦０逦０逡逑图１邋１５种与雌激素及硫酸羟氯喹具有相似化学结构的药物单体结构逡逑实验室前期己经从人类基因组中成功克隆出大小为９６４ｂｐ的ＡＱＰ５启动子序逡逑列，并成功获得了荧光素酶报告基因重组质粒。药物筛选范围确认后，我们选用逡逑相同浓度（１０＿６Ｍ）的不同药物单体作用于２９３Ｔ细胞，并以ＰＢＳ组作为阴对照，逡逑利用ＡＱＰ５启动子细胞模型筛选发现，芹菜素、芒柄花素、白藜芦醇等药物可以逡逑１７逡逑

启动子,单体,芹菜素,蛋白表达

逡逑激活ＡＱＰ５的启动子活性，结果见图２。逡逑ｐＧＬ２－ＡＱＰ５邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ逡逑０．０１２－１邋＊逡逑图２不同药物单体对ＡＱＰ５启动子转录活性的影响逡逑（＊邋Ｐ＜０．邋０５邋＊＊邋Ｐ＜０．邋０１邋＊＊＊邋Ｐ＜０．邋００１）逡逑３．１．２芹菜素可明显促进人颌下腺润管上皮细胞中ＡＱＰ５的蛋白表达逡逑根据双荧光素酶报告基因药物筛选结果，除去原阿片碱、钩藤碱及蝙蝠葛碱逡逑三种对ＡＱＰ５启动子活性有明显抑制作用的中药单体，我们选取余下的１２种药逡逑物进一步探究中药单体对ＡＱＰ５蛋白表达的影响。逡逑实验选择药物浓度为１０＿６Ｍ不同中药单体成分作用于人颌下腺闰管上皮细逡逑胞（ＨＳＧ）邋，邋４８小时后，细胞收样，通过ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ实验检测ＨＳＧ细胞中的逡逑ＡＱＰ５蛋白表达水平，结果如图３所示。以ｐ－ａｃｔｉｎ作为内对照，，ＰＢＳ组为对照组，逡逑芹菜素上调ＡＱＰ５蛋白表达的能力最强。逡逑１８逡逑
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R781

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