变形链球菌耐酸相关基因luxS编码蛋白的晶体学初步研究

发布时间：2020-04-22 09:35

【摘要】：目的：龋病是牙体硬组织的细菌感染性疾病，是人类最常见的疾病之一，尤其多发于儿童。细菌学研究和动物模型实验研究均证实变形链球菌是最主要的致龋菌。其致龋作用的发挥与其耐酸性息息相关，变形链球菌耐酸相关基因luxS编码的核糖基高半胱氨酸酶，通过一系列酶促反应合成自体诱导物信号分子AI-2，AI-2作为种属间的通用信号分子，参与群体感应系统监测菌群密度，调控细菌的生物功能进而影响生物膜的形成，增强菌群的耐酸能力和抗药能力，可见核糖基高半胱氨酸酶在变形链球菌的耐酸作用中发挥关键的作用。迄今为止，变形链球菌的耐酸机制仍不清晰，我们希望通过对变形链球菌耐酸相关基因luxS编码的核糖基高半胱氨酸酶的晶体结构研究，更深刻的揭示变形链球菌的耐酸机制，也为龋病的防治提供新的思路和理论指导。方法：重组质粒的构建与鉴定根据GenBank中luxS基因序列，设计特异性PCR引物，扩增luxS基因序列，将其克隆至pGEX-6p-1载体中，构建GST标签融合的重组质粒。目标蛋白的诱导表达与纯化将鉴定正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中， IPTG诱导表达，用SDS-PAGE和质谱分析表达的目标蛋白。利用GST亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化目标蛋白。目标蛋白的结晶与结构解析使用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒对纯度达95%以上的目标蛋白进行晶体生长条件筛选，对初筛的生长条件进行优化，以期得到适于X射线衍射的单晶，，通过同步辐射加速器收集晶体衍射数据，借助于CCP4等一系列蛋白结构解析软件进行结构解析。结果：核糖基高半胱氨酸酶在大肠杆菌中高效、可溶性表达，经SDS-PAGE及质谱鉴定分析，证实所表达的蛋白为核糖基高半胱氨酸酶。对核糖基高半胱氨酸酶的表达及纯化条件进行优化，确立了目标蛋白的纯化工艺，经SDS-PAGE分析，最终得到纯度高达95%以上的目标蛋白。使用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒对晶体生长条件进行筛选，得到目标蛋白的晶体生长条件，进一步对晶体生长条件进行优化，得到适于X射线衍射数据收集的单晶。在北京同步辐射光源收集核糖基高半胱氨酸酶晶体的X射线衍射数据，晶体衍射分辨率达到2.4A，属于C2221空间群。结论：成功的在大肠杆菌中高效表达了变形链球菌耐酸相关基因luxS编码的核糖基高半胱氨酸酶蛋白，建立完善的蛋白纯化工艺，并成功得到核糖基高半胱氨酸酶的晶体，分析晶体X射线衍射数据。
【图文】：

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菌株 coli XL-1 blue 首都医科大学分子生物学与生物化学实验室 coli BL21(DE3) 首都医科大学分子生物学与生物化学实验室reptococcus mutans UA159 首都医科大学分子生物学与生物化学实验室质粒载体EX-6p-1 用于构建原核表达载体（Novagen）（图 1）。pGEX 载体系统是隆表达重组蛋白的功能最强大的系统之一。在 pGEX 载体上构建有重组Schistosoma japonicum）GST 蛋白（分子量 26kd）的结构，GST 天然存物体内，带有全长 GST 标签的蛋白被证实具有 GST 酶的活性，能够二EX 载体上多克隆位点上游包含有蛋白酶的识别序列（图 2），可根据需的蛋白酶切除[18]。

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图 2 pGEX-6p-1 多克隆位点及酶切位点ig.2 Multiple cloning site and protease cleavage site map of pGEX-6p-1.3 工具酶及 DNA、蛋白质分子量 MarkerBamH I 限制性内切酶 New England BiolabsXhol I 限制性内切酶 New England BiolabsT4 DNA 连接酶 New England Biolabspfu Polymerase 首都医科大学分子生物学与生物化学实验室提供DNA Marker 首都医科大学分子生物学与生物化学实验室提供蛋白质分子量 Marker TaKaRa 公司.4 试剂盒细菌基因组 DNA 提取试剂盒北京天为时代公司DNA 凝胶回收试剂盒 Omega 公司
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R781.1

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