胰岛素样生长因子1对人牙周膜干细胞骨向分化调控机制的研究

发布时间：2020-04-22 18:00

【摘要】：胰岛素样生长因子-1是一类具有促有丝分裂的蛋白质，可以促进牙周膜成纤维细胞骨向分化。然而，外源性的胰岛素样生长因子是否能促进人牙周膜干细胞的增殖、骨向分化及其调控机制仍不明确。本实验将从下述三个部分对这一问题进行探讨。 1.人牙周膜干细胞体外分离培养及鉴定 目的：获得纯化的人牙周膜干细胞。方法：经患者同意收集临床上因正畸拔除的前磨牙，采用酶消化法进行牙周膜干细胞原代培养。采用有限稀释法及免疫磁珠分选法对原代培养的牙周膜干细胞行进纯化。倒置显微镜下观察细胞形态、生长状况及克隆形成情况。采用MTT法、流式细胞术方法对细胞增殖情况及细胞周期分布分析。通过细胞免疫化学方法对细胞来源进行鉴定。结果：人牙周膜干细胞为成纤维细胞形态，抗VIM染色阳性，抗CK染色阴性，，为间充质来源；MTT法绘制生长曲线计算群体倍增时间为45.74±0.91h；流式细胞术分析细胞周期分布计算增殖指数为25.58%。结论：通过酶消化法、有限稀释法及免疫磁珠法获得纯化的人牙周膜干细胞，体外培养呈现出成纤维细胞克隆生长，具有较快的增殖能力，属于间质来源的成体干细胞。 2.胰岛素样生长因子-1对人牙周膜干细胞增殖能力及骨向分化能力的影响 目的：为探讨外源性胰岛素样生长因子-1对人牙周膜干细胞增殖能力及骨向分化能力的影响。方法：体外研究：利用MTT法并结合相关文献确定胰岛素样生长因子-1对人牙周膜干细胞作用的最佳浓度。流式细胞术分析细胞周期及绘制生长曲线检测细胞增殖能力，透射电镜观察细胞器的改变；检测碱性磷酸酶活性，茜素红钙化结节染色，实时荧光定量RT-PCR及Westernblot检测相关基因/蛋白表达量改变情况；体内实验：以1×106密度收集IGF-1诱导7d及未经胰岛素样生长因子-1诱导的人牙周膜干细胞与明胶海绵复合后移植到大鼠的肾被膜下，3W后取材、固定、脱矿、包埋、连续切片，进行HE染色及IHC染色检测移植物组织形态及相关蛋白表达情况。结果：确定IGF-1对人牙周膜干细胞的最佳作用浓度为100ng/mL。IGF-1刺激后碱性磷酸酶活性增高，茜素红染色后CPC定量分析钙离子含量升高。实时荧光定量RT-PCR及Westernblot显示在IGF-1刺激后相关基因蛋白(RUNX2/RUNX2，OSX/OSX,OCN/OCN)表达上调。体内结果显示：IGF-1诱导后的人牙周膜干细胞在肾被膜下形成的组织HE染色可见较大面积的骨样组织；免疫组织化学染色RUNX2,OSX,OCN阳性表达强于未经IGF-1刺激的对照组。结论：IGF-1可促进人牙周膜干细胞增殖及骨向分化能力。 3.胰岛素样生长因子-1通过激活ERK/JNKMAPK信号通路促进人牙周膜干细胞的骨向分化 目的：探讨IGF-1在促进人牙周膜干细胞骨向分化中的作用机制。方法：采用Westernblot方法检测MAPK信号通路蛋白磷酸化水平；采用荧光实时定量RT-PCR的方法检测MAPK信号通路被抑制后，IGF-1对人牙周膜干细胞RUNX2,OSXmRNA表达的影响。结果：IGF-1激活人牙周膜干细胞ERK/JNKMAPK信号通路。实时荧光定量RT-PCR显示：在ERK/JNKMAPK通路被抑制后，IGF-1不能上调RUNX2,OSXmRNA的表达。结论：IGF-1可能是通过激活ERK/JNKMAPK信号通路促进人牙周膜干细胞的骨向分化能力。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R780.2

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本文编号：2636783