IL-1β在LPS诱导山羊颞下颌关节盘细胞炎症反应中的作用研究

发布时间：2020-04-25 13:46

【摘要】：目的:颞下颌关节(Temporomandibular joint,TMJ)盘结构改变是由非炎症起源代偿重塑组织功能失调引起继发炎症致组织结构破坏所导致。本实验采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用于山羊颞下颌关节盘细胞,对山羊TMJ关节盘细胞进行炎症诱导,探索炎症环境对山羊TMJ关节盘细胞的影响。探究白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)在炎症反应中的作用,以及IL-1β对山羊TMJ关节盘细胞及细胞外基质的影响。方法:一、LPS浓度筛选实验:体外分离山羊TMJ关节盘组织,培养山羊TMJ关节盘细胞。使用MTT检测不同浓度LPS(0、0.1、1、10、100μg/mL)对山羊TMJ关节盘细胞增殖的影响。台盼蓝染色观察山羊TMJ关节盘细胞的存活状态。使用qRT-PCR检测各浓度组中IL-1β的表达水平。运用ELISA检测IL-6、TNF-α的分泌水平。在甲苯胺蓝、天狼星红染色后观察加药后山羊TMJ关节盘细胞外基质中糖胺聚糖、总胶原表达情况。二、IL-1β作用于山羊TMJ关节盘细胞及细胞外基质的实验:按照实验要求将实验组分为:空白对照组、加LPS(10μg/mL)培养组、加IL-1β(10ng/mL)培养组、加LPS(10μg/mL)+IL-1β(10ng/mL)培养组,MTT检测各组对山羊TMJ盘细胞增殖能力的影响。通过ELISA检测各实验组中IL-6、TNF-α的分泌水平。利用甲苯胺蓝、天狼星红和I型胶原免疫组化染色观察各组中山羊TMJ盘细胞外基质中糖胺聚糖、总胶原以及I型胶原的表达情况。通过qRT-PCR检测各组中相关基因mRNA的表达情况。结果:镜下观察山羊TMJ关节盘细胞形态呈长梭形。I型胶原免疫组化染色、甲苯胺蓝染色结果示阳性。MTT结果示,相比对照组不同浓度的LPS作用于细胞24h后均对其增殖能力有抑制(p0.05)。作用24h后,LPS(10μg/mL)相比对照组细胞活性下降较多。台盼蓝染色结果显示LPS(10μg/mL)组细胞胞膜有部分透蓝,胞膜连续性下降,细胞碎散,大部分细胞存活。小浓度LPS(0、5、10、15μg/mL)MTT检测示24h后LPS对山羊TMJ关节盘细胞增殖抑制依赖剂量增长。qRT-PCR示相比对照组,三个实验组中IL-1βmRNA的表达水平均上调(p0.05)。ELISA检测示相较于对照组,LPS(10μg/mL)组IL-6、TNF-α的分泌水平呈明显的上升(p0.05)。甲苯胺蓝和天狼星红染色显示相比对照组LPS(10μg/mL)组阳性结果明显。综上所述,选择LPS(10μg/mL)作用24h作为适宜的实验浓度和时间。LPS、IL-1β分别作用于山羊TMJ关节盘细胞,相比对照组LPS+IL-1β组细胞活性明显下降。三个实验组均对山羊TMJ关节盘细胞增殖存在抑制(p0.05)。ELISA检测示LPS组、LPS+IL-1β组较对照组中IL-6、TNF-α分泌水平上升显著(p0.05)。甲苯胺蓝染色、天狼星红染色、I型胶原免疫组化染色示:相比对照组LPS+IL-1β组染色阳性表达减少。qRT-PCR示与对照组相比LPS+IL-1β组Ⅰ型胶原蛋白表达水平下降。LPS+IL-1β组Aggrecan蛋白的表达与对照组相比下降。与对照组相比LPS+IL-1β组MMP-1、MMP-3和MMP-13表达水平均明显上调(p0.05)。结论:1、LPS诱导炎症后可产生IL-1β和其他炎症因子,且炎症反应对山羊TMJ关节盘细胞形态、增殖和细胞外基质蛋白有影响作用。2、IL-1β与LPS共同作用对山羊TMJ关节盘细胞的增殖、细胞外基质中胶原蛋白及蛋白聚糖的表达有抑制作用,并促进炎症反应过程中MMP-1、MMP-3以及MMP-13的表达。
【图文】：

关节盘,山羊,细胞

使用 PrimeScriptTMRT 逆转录试剂盒、PCR 试剂盒检测 IL-1β mRNA 表达。2.3.8 结果处理采用 SPSS 24.0 统计软件分析，实验数据以 mean ±S.D.形式表示，多组数据使用单因素方差分析（ANOVA），各组间数据差异比较采用 LSD 检验，两组数据间使用配对 t 检验。*表示 p<0.05，为差异有统计学意义，检验水平α=0.05。2.4 实验结果2.4.1 细胞形态观察细胞形态：镜下可见细胞呈长梭形，山羊 TMJ 关节盘细胞以成纤维细胞样细胞为主。I 型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色结果呈阳性，提示山羊 TMJ关节盘细胞 ECM 存在 I 型胶原和 GAG 蛋白。

山羊,关节盘,相对活性,诱导作用

Fig. 1 Culture and observation of goat TMJ disc cells2.4.2 MTT 检测 LPS 诱导对山羊 TMJ 盘细胞增殖的影响LPS(100μg/mL)组在加药 24 小时后细胞存活率为 60.861%，LPS(0.1μg/mL)、LPS(1μg/mL)组分别为 95.611%和 93.253%，，LPS(10μg/mL)组作用细胞后 24 小时细胞相对存活率为 84.092%。相比对照组，LPS 诱导 24h 后各组细胞相对活力均有下降，提示 LPS 给药后会抑制细胞活力。LPS(0.1μg/mL)、LPS(1μg/mL)两组与对照组相比，细胞活性下降不明显，组间差异小。LPS(10μg/mL)组相比对照组细胞活性下降较多。LPS(100μg/mL)组相比对照组细胞活性下降明显，与LPS(10μg/mL)组相比差异明显。在给药 48 后 LPS(0.1μg/mL)、LPS(1μg/mL)两组相比对照组细胞活性仍有所下降，但分别与 72h、96h、120h 时两组的细胞活力对比，后面三个时间点两组细胞活力有所上升。24h 时 LPS(10μg/mL)组相比其他时间点该组的细胞活力呈逐渐下降趋势。LPS(100μg/mL)组在 24h 到 72h 三个时间段内每组细胞活力均呈下降趋势。总体来看 24 小时为较适宜的炎症反应时间。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R782.6

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