胃癌前病变患者口腔中龋病和牙周病相关细菌以及口腔细菌多样性的研究

发布时间：2020-04-27 15:30

【摘要】：龋病和牙周病是人类最常见的感染性疾病。龋病是一种发生在牙体硬组织的慢性感染性疾病,变异链球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)和表兄链球菌(Streptococcus sobrinus, S. sobrinus)在龋齿中的检出率最高,被认为是最主要的致龋菌,能够利用糖产酸溶解牙釉质和牙本质中的无机物,因此龋病以硬组织脱矿、龋洞形成为主要特征。牙周病以牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齿松动为主要特征,流行病学研究表明牙周病与很多全身系统性疾病关系密切,这些系统性疾病包括：心血管疾病,胃炎及胃癌,艾滋病,早产低出生体重儿,糖尿病,呼吸道感染和骨质疏松症,得出牙周病是多种系统性疾病的危险因素之一的结论并不为过。细胞因子和炎性介质增多、直接感染、细菌抗原和自身抗原之间的交叉反应性／分子拟态能够引起系统性疾病,有报道,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)其发展密切相关。而且,已经在心脏瓣膜病变、粥样斑块、早产高危孕妇的羊膜液以及早产孕妇的胎盘中检测到P. gingivalis等牙周病相关病原菌。另一种牙周主要病原菌伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)也在除口腔外的身体其他病变部位被检测到。尽管P.gingivalis和A. actinomycetemcomitans等牙周病相关细菌在系统性疾病中的作用尚不明确,但是这些细菌与全身疾病的关系这一方向值得探索。胃癌前病变(Precancerous lesions of gastric cancer, PLGC)是一个病理性概念,包括肠上皮化生(Intestinal Metaplasia, IM)和异型增生(Dysplasia, Dys),主要伴存于慢性萎缩性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis, CAG),是从正常胃粘膜向胃癌转化过程中的一个重要阶段。这里我们主要研究龋病和牙周病及其主要病原菌与胃癌前病变的关系,并探索胃癌前病变患者口腔细菌的多样性。第一部分胃癌前病变患者的人口学特征和临床口腔状况评估尽管过去的几十年来胃癌的发病率显著降低,它仍然是世界范围内第二大恶性肿瘤,在西方国家更是如此。胃癌的发病原因不明,可能与多种因素,如生活习惯、饮食种类、环境因素、遗传素质、精神因素等有关。幽门螺杆菌是胃部最常感染的细菌也是慢性胃炎最主要的致病菌。研究提示,龈下菌斑和牙周袋很可能是幽门螺杆菌的潜在聚集地。很多流行病学调查研究发现,自述牙齿丧失与胃癌的风险呈正相关。牙齿丧失最常见的原因是龋病或牙周疾病,在年轻人群中前者较多,对于年龄较长的人群,后者所占比重较大。但是尽管牙齿丧失在一定程度上是衡量牙周疾病的一个重要指标,它仍然不能作为一种直接的手段,我们需要牙周病的临床和微生物学指标以及牙齿脱落的病史等相关信息来探讨胃癌与其之间的关系。本部分研究从年龄、性别、种族、受教育程度、收入水平、婚姻状况和身高体重指数BMI等方面,评估研究人群的胃癌的人口统计学风险因素和口腔健康状况之间的关系。方法：本实验选取New York Harbor Healthcare System (VANYHHS)和Bellevue Hospital Center胃肠科2009年3月30日至2011年4月27日之间,约定进行上消化道内窥镜检查的98名应试者。研究对象纳入标准为：30岁以上,无食管癌、胃癌、胃静脉曲张或门静脉高压性胃病。按病理诊断结果,将研究对象分为两组：对照组无任何症状或仅有浅表性胃炎；病例组患有胃癌前病变(包括慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生或异型增生)。口腔检查时进行龋病和牙周病的临床状况评估。SPSS17.0统计学软件分析病例组和对照组人群的胃癌的人口统计学风险因素。结果：胃癌前病变患者的龋病相关临床指标与对照组未见显著性差异。与健康对照组相比,胃癌前病变患者的牙周健康状况较差,病例组的牙周袋深度(Pocket depth, PD)的均值、附着丧失(Loss of attachment, LOA)均值、PD≥4mm的位点数所占的百分比、LOA≥3mm和LOA≥5mm的位点数所占的百分比以及探诊出血的位点数所占的百分比等所有牙周临床检查指标均高于对照组。结论：胃癌前病变患者的牙周健康状况较差,龋病相关临床指标与健康对照组未见显著差异。第二部分胃癌前病变患者口腔中龋病和牙周病相关细菌的研究有研究报道,慢性炎症是疾病进展初期的主要原因,由于牙周致病菌感染可以导致慢性系统性炎症,而后者又是胃癌发展过程中的重要的危险因素,我们推测,牙周主要致病菌的存在增加了胃癌发生发展的风险。为了验证此假说,我们进行了一项临床探索性的病例-对照研究,通过实时定量PCR检测唾液以及牙菌斑样本中的四种牙周病相关主要致病菌：牙龈卟啉单胞菌(Pg)；福赛斯坦纳菌(Tannerella forsythensis, Tf);牙密螺旋体(Treponema denticola, Td);伴放线放线杆菌(Aa)；两种龋病相关主要致病菌：变异链球菌(Sm)和表兄链球菌(Sb)。结合临床相关指标以及患者的人口统计学胃癌风险因子,探索口腔感染性疾病与胃癌的发生发展是否存在一定的相关性。方法：研究对象同第一部分。口腔检查时采集唾液和牙菌斑样本,MasterPure DNA纯化试剂盒提取样本的细菌基因组DNA后进行实时定量PCR检测样本中的特异性细菌。以特异性细菌的标准菌株DNA作为阳性对照,以灭菌水作为阴性对照,通过标准DNA产生的标准曲线对样本中的目标细菌进行绝对定量。SPSS 17.0统计软件行临床指标、风险因素以及微生物水平之间的相关性统计学分析。结果：研究人群唾液中牙周主要致病菌的DNA水平与牙菌斑中的DNA水平呈正相关。Pg, Td和Tf检出阳性的人群,平均牙周袋深度显著大于检出阴性的人群,中重度牙周袋(PD4mm)和探诊出血的位点数也显著高于阴性人群。Pg、Td和Tf的DNA水平与牙周袋深度显著相关,其中Pg和Td的DNA水平还与被测人群的中重度牙周袋和探诊出血的位点数密切相关。龋病和牙周病主要致病菌的检出率,在胃癌前病变患者和健康对照组两组间有所不同。胃癌前病变患者的牙周病主要病原菌Pg和Td的阳性率高于对照组,唾液和龈下菌斑中四种牙周病原菌的DNA水平也略高于对照组,但统计学上无显著性差异。结论：Pg、Tf、Td三者与牙周病的临床指标,尤其是牙周袋深度和探诊出血密切相关。与健康对照组相比,胃癌前病变患者Pg和Td的阳性检出率较高,四种牙周病原菌的DNA水平也较高。第三部分胃癌前病变患者口腔细菌多样性的研究口腔中的微生物群体是目前所知的最为复杂的微生物群落之一。随着分子生物学检测技术的提高,目前已明确鉴别出口腔细菌群落或生物膜中包含至少500种微生物。口腔这一众多微生物栖息的场所,对于人类健康和疾病都有着至关重要的意义。口腔是消化道的开端,常常被成为"inner outside",解剖学上讲消化道由连续的器官构成,胃也属于消化系统,口腔和胃的微生物在某种程度上能够互相影响。一方面,口腔中的细菌可以通过摄入食物被带入胃内,另一方面,口腔菌群也有可能受到胃部疾病影响。例如,有些胃癌患者会伴发胃食管返流疾病(Gastroesophageal Reflux Disease, GERD),返流物能够造成上消化道系统的相应病变,改变其正常细菌群落,若发生呕吐症状,还可影响到口腔。因此,我们推测,胃癌前病变患者的口腔细菌多样性与健康人群不同。本研究采用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳分析技术(polymerase chain reaction-based denaturing gradient gel electrophoresis technique, PCR-DGGE)作为手段分析胃癌前病变患者口腔中唾液和牙菌斑样本的细菌多样性,同时分析牙周病原菌的存在对口腔细菌多样性的影响。方法：研究对象同第一部分。唾液和牙菌斑样本DNA的提取同第二部分。采用GeneAmp PCR SystemTM 9700进行巢式PCR。制备变形梯度凝胶,PCR产物和特异性DGGE参考Maker上样,在pH 8.5温度为58℃的1×Tris-acetate-EDTA (TAE)电泳缓冲液中恒压60 V电泳17小时。电泳结束后取下凝胶,在0.5μg/mL的EB溶液中染色12分钟,蒸馏水中漂洗6分钟后,AlphalmagerTM 3300 System采集DGGE图像,BioNumerics软件分析图像,SPSS17.0统计软件分析微生物学指标和细菌多样性之间的相关性。结果：胃癌前病变患者的龈下菌斑样本的DGGE条带数为35.6,显著高于对照组的33.2(p0.05),但两组间唾液样本的DGGE条带数量,未见显著性差异。整体研究人群的6个不同牙位点龈下菌斑之间的相似性达80.7%,而唾液和龈下菌斑的相似性只有78.0%。病例组唾液样本和龈下菌斑样本的相似程度(76.5%)略低于健康对照组(78.6)；病例组不同牙位龈下菌斑样本之间的相似程度却比对照组略高。不同牙位龈下菌斑之间的相似性越高,龈下菌斑样本的细菌多样性越高(p0.001)。牙周病原菌在多牙位(≥2)检出阳性的人群,唾液样本DGGE条带数低于只有一个牙位检出阳性或全部牙位检出阴性的人群,龈下菌斑的多样性情况与此相反,Pg, Td和Tf多牙位检出阳性的人群,龈下菌斑的DGGE条带数均高于只有一个牙位检出阳性或全部牙位检出阴性的人群的人群。结论：胃癌前病变患者口腔中龈下菌斑的细菌多样性略高于健康人群,同种来源样本(不同牙位龈下菌斑)细菌多样性的相似程度高于不同来源样本(唾液和龈下菌斑)。龈下菌斑的细菌多样性和各牙位龈下菌斑相似性高度相关。牙周病原菌在多位点检出阳性的人群,唾液细菌多样性有所下降,而龈下菌斑细菌多样性有所升高。
【图文】：

图谱,溶解曲线,标准曲线,标准曲线

075已O卜一~，}图3一 3CT值图谱(A)、标准曲线(B)和溶解曲线图谱(C)(以Pg为例) F193一 3CTvalue， standardeurveandmeltingeurveofreal一 timeqPCR(takePg省sexamPle)讨论实时定量PCR技术，是在传统定量PCR的基础上发展起来的一种先进的核酸定量方法，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过CT值和标准曲线对样品中的DNA(或cDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或eDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法 (Balajeeeta一，2007)。实时定量PeR的基本原理是:扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比

凝胶电泳,产物,牙菌斑,电泳

在PCR产物中加入10x上样缓冲液，在1.5%琼脂糖凝胶中60V电泳1小时，染色、漂洗，凝胶成像系统拍照。8.统计分析采用optieonMonitorReal一TimeAnalysis50伽are2.0分析软件对实时定量pCR的结果进行分析，使用统计软件SPssl7.0分析实验所得数据，Chi一Square(才)检验比较不同细菌的分布情况，Kruskal一WalhS非参数检验比较不同组别DNA水平的差异，P值小于0.05，则认为有显著性差异。结果一PCR产物电泳结果唾液和牙菌斑样本PCR均与预期结果一致，，如图4一2扩增所得产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果条带大小所示。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R781.4

【参考文献】