诱导大鼠脂肪来源干细胞向腺泡样细胞转化的实验研究

发布时间：2020-04-30 23:43

【摘要】：背景:唾液腺是外分泌腺体,其分泌的唾液有湿润口腔,促进消化的作用,其次,对于味觉,语言,龋齿的预防均有着密切的关系。口干是由客观涎液分泌量减少导致的一种主观感觉,常因恶性肿瘤放疗以及自身免疫系统疾病(Sjogren' s syndrome,SS)等引起。目前临床上只是针对口干这一主观感受来对症治疗,却不能从根本上解除病人的痛苦。近年来,细胞疗法和组织工程的兴起为口干症的治疗带来曙光,脂肪干细胞作为一种可能的种子细胞也受到人们的关注,本文将探讨将大鼠脂肪干细胞转化成腺泡样细胞的可行性。目的:体外培养大鼠脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),并探究其在下颌下腺细胞(submandubular gland cells,SMGCs)裂解液模拟的微环境体外实验中,是否具有转化为有分泌功能的腺泡样细胞的能力,可否作为一种可供选择的种子细胞应用在涎腺组织工程中。方法:在无菌环境中获得3周龄清洁级SD大鼠腹股沟处皮下脂肪带,提取ADSCs并传代,应用倒置相差显微镜,HE染色来查看细胞的形态,CCK8法检测并据此做生长曲线折线图,成骨诱导及成脂诱导鉴定其是否能向骨组织,脂肪组织分化。制备下颌下腺细胞裂解液,将第三代脂肪来源干细胞分为对照组与试验组。对试验组施加下颌下腺细胞裂解液干预,每次换液时进行形态学观察;对对照组,实验组进行CK8及α-Amylase免疫荧光染色,并用淀粉酶检测试剂盒检测诱导不同时间的实验组分别在第7天,14天,21天时细胞培养液上清液内淀粉酶的含量,分析转化效率。结果:成功提取SD大鼠腹股沟处皮下的ADSCs:原代细胞24 h后半量换液,可贴壁生长的细胞的数量较少,多为扁圆形,大部分细胞不贴壁,在换液时即可被去除,48 h后贴壁的细胞数量变多,形状变为不规则,4天后形态逐渐一致,呈多角形或梭型,排列较为疏松,在传代后细胞形状呈长梭型,分布方向规律,如同漩涡。传代之后,细胞开始迅速生长,约2-3天即可传代,再次传代时形态无明显变化。HE染色后,胞核为蓝色并且胞核饱满,胞质被染为红色,形状规则,细胞呈长梭型。通过CCK8法测OD值并绘制ADSCs成长曲线,可见细胞生长整体呈”S”型,与以往文献结论一致。提取的ADSCs成脂诱导后,在第21天进行检测时呈现大量大小不等的脂滴,被油红”O”染成红色;成骨诱导后,在第14天左右可出现不透光区域即所谓的”钙结节”,碱性磷酸酶检测细胞胞质呈深棕色,细胞形态不规则。成功诱导ADSCs转分化为具有分泌功能的涎腺腺泡样细胞:随着诱导天数逐渐增加,呈长梭型的细胞逐渐发生变化,呈多角形或”鹅卵石状”细胞数量逐渐增多,细胞胞质中出现类似脂滴的分泌小泡,但与之前比较,数目更多,体积更小。免疫组化分析诱导完成后的细胞α-Amylase抗体及Cytokeratin-8检测阳性,而对照组呈阴性。用大鼠淀粉酶(AMY)酶联免疫试剂盒对诱导组细胞上清液进行检测,发现随着时间推移,脂肪来源干细胞转化率不断提高,但转化的速度不断降低。结论:具有多向分化能力的大鼠原代ADSCs细胞可通过酶消化获得,并可传代培养。脂肪来源的干细胞可转化为分泌α-淀粉酶功能的腺泡样细胞,其转化效率随时间逐渐增加。
【图文】：

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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R78

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