三种口腔癌原位异种移植瘤模型增殖、转移的比较及相关影响因素的初步研究

发布时间：2020-05-04 17:25

【摘要】：目的:近年来,将肿瘤细胞植入裸鼠口腔构建的原位异种移植瘤模型已广泛应用于口腔癌的研究。但在某些研究中为了快速评估某些新型靶向药物对头颈部肿瘤体内增殖抑制的初步效果,需要快速构建以成瘤时间短、肿瘤生长速度快为主要特点的移植瘤模型;另一方面,在某些与肿瘤转移相关的研究中,需要构建以淋巴结转移率高为主要特点的移植瘤模型。然而以往有关比较不同细胞系构建的口腔癌原位异种移植瘤模型在肿瘤形成时间、增殖速度、转移水平等方面差异的总结报道相对较少,探索使用何种口腔癌细胞系可短时间内构建以增殖速度快为主要特点的移植瘤模型,或者是以转移率高为主要特点的移植瘤模型,是提高构建口腔癌原位异种移植瘤模型效率,需要解决的首要问题。此外,不同口腔癌细胞系构建的原位异种移植瘤模型在肿瘤形成、增殖及转移等方面具有差异的原因尚不明确,因此本研究拟使用在口腔癌研究中使用较多的CAL27、SCC9及SAS三种人舌癌细胞系构建口腔癌原位异种移植瘤裸鼠模型,比较三组移植瘤模型在肿瘤形成时间、增殖速度、转移水平等方面的差异,并对与肿瘤原位增殖及转移可能相关的影响因素进行初步分析,旨为提高移植瘤模型构建的效率,并为需要构建符合研究目的口腔癌原位异种移植瘤模型的研究者提供选择性参考。方法:(1)预实验中将45只裸鼠随机分为9组,每组5只,调节CAL27、SCC9及SAS细胞至5×10~6个/ml、1×10~7个/ml和2×10~7个/ml 3个不同细胞浓度,分别于每组裸鼠舌部注入50ul细胞悬液,观测裸鼠舌部成瘤情况,选出合适的细胞浓度用于后续实验研究。(2)将15只裸鼠随机分为3组,每组5只,分别于舌部注射2×10~7个/ml细胞浓度的人舌癌细胞CAL27、SCC9及SAS构建口腔癌原位异种移植瘤模型。(3)每日观察,确定原位肿瘤形成时间;肿瘤形成后隔日测量原位肿瘤体积,评估移植瘤体内生长速度。(4)舌组织HE染色判定原位肿瘤形成情况,免疫组化增殖细胞核抗原(Ki67)染色判定肿瘤细胞体内增殖水平。(5)下颌下淋巴结HE染色及免疫组化细胞角蛋白(CK)染色判定原位异种移植瘤模型淋巴结转移水平。(6)细胞计数法观测CAL27、SCC9及SAS三组细胞系体外增殖情况。(7)划痕实验比较三组细胞体外迁移能力。(8)RT-PCR检测三组细胞系中增殖、转移相关生物分子:表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)、基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、CD44、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞间粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule 1,ICAM-1)等mRNA的表达水平。结果:(1)使用CAL27、SCC9、SAS细胞成功构建口腔癌原位异种移植瘤模型。当注射细胞浓度为2×10~7个/ml时,三组细胞诱导构建移植瘤模型成功率较高,CAL27、SAS组移植瘤模型舌部植入肿瘤细胞后约3天可见肿瘤形成,成瘤率100%;SCC9组移植瘤模型舌部植入肿瘤细胞后约4周可见肿瘤形成,成瘤率80%。(2)2×10~7个/ml细胞浓度下成功构建原位异种移植瘤模型,三组移植瘤生长速度由快到慢、原位肿瘤体积由大到小依次为SAS组、CAL27组、SCC9组。(3)三组移植瘤中Ki67阳性细胞率由高到低依次为SAS组(65.13%±5.24%)、CAL27组(21.02%±2.50%)、SCC9组(5.24%±3.42%)(P0.05)。(4)三组细胞体外增殖情况、细胞中EGFR mRNA表达水平由高到低依次为SAS组、CAL27组、SCC9组,细胞中N-cadherin mRNA表达水平由低到高依次为SAS组、CAL27组、SCC9组,结果与移植瘤模型肿瘤增殖情况趋势一致。(5)HE染色示三组移植瘤模型下颌下淋巴结转移水平由高到低依次为SCC9组(90%)、SAS组(40%)、CAL27组(20%)(P0.01)。(6)三组移植瘤模型下颌下淋巴结中CK阳性转移细胞率由高到低依次为SCC9组(51.73%±17.59%)、SAS组(19.64%±9.66%)、CAL27组(8.79%±4.51%)(P0.05)。(7)三组细胞体外迁移能力、细胞中MMP9、E-cadherin mRNA的表达水平由高到低依次为SCC9组、SAS组、CAL27组,结果与三组移植瘤模型淋巴结转移情况趋势一致。(8)三组细胞中CD44、cyclin D1和ICAM-1 mRNA的表达水平与三组细胞构建的移植瘤模型肿瘤增殖及淋巴结转移水平趋势无明显相关性。结论:(1)CAL27、SAS细胞构建的原位异种移植瘤裸鼠模型肿瘤生长速度快,成瘤时间短,适合需要快速建模,探讨原发肿瘤增殖的研究使用。(2)SCC9细胞构建的原位异种移植瘤模型淋巴结转移成功率高,更适用于肿瘤转移相关的研究。(3)CAL27、SCC9、SAS三种口腔癌原位异种移植瘤模型中,移植瘤增殖水平可能与口腔癌细胞体外增殖水平、细胞系中EGFR mRNA的高表达、N-cadherin mRNA的低表达有关;细胞体外迁移能力、细胞中MMP9、E-cadherin mRNA的表达水平可能对原位移植瘤模型的淋巴道转移有较强影响。
【图文】：

移植瘤,肌组织,细胞

图 2-1 HE（100×）染色示 CAL27、SCC9 和 SAS 细胞 2×107个/ml 组舌部移植瘤形成，周围肌组织排列紊乱。Fig 2-1 HE staining (100×) uncovered orthotopic tongue tumor masses formation in groups CAL27,SCC9, and SAS at 2×107/ml cell concentration, and the surrounding muscle tissue was disordered.2.2 CAL27、SCC9 和 SAS 三组口腔癌原位异种移植瘤模型肿瘤增殖情况比较为进一步研究 CAL27、SCC9 和 SAS 三组移植瘤模型原位肿瘤增殖情况的差异，我们在 2×107个/ml 细胞浓度下构建原位移植瘤模型，比较三组移植瘤生长情况及细胞体内增殖情况。裸鼠舌部移植瘤形成后 1、3、5、7、9 天测量三组肿瘤体积并进行比较。结果显示，从肿瘤形成后第 3 天开始，CAL27 组（5.05±2.43）和 SASCAL27 SCC9SAS

移植瘤,生长情况,裸鼠

25图 2-2 CAL27、SCC9、SAS 细胞诱导的移植瘤生长情况比较。Fig 2-2 A comparison of tumor growth of CAL27-, SCC9-, and SAS-induced primary tu（A）原位注射 CAL27、SCC9、SAS 细胞成功诱导裸鼠舌部移植瘤形成，成瘤后第 9 天大体瘤大小 SAS 组>CAL27 组>SCC9 组；（B）成瘤后每两天测量一次肿瘤体积，自成瘤后第三天组和 CAL27 组移植瘤与 SCC9 组相比明显增大，，SAS 组移植瘤稍大于 CAL27 组。**P <处死裸鼠后取舌组织做 HE 染色判定肿瘤形成，结果显示，肉眼物形成的 CAL27、SCC9、SAS 三组裸鼠舌组织 HE 染色均显示为肿瘤2-3）。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.8

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