miR-467f对高糖环境下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的调节机制研究

发布时间：2020-05-07 00:56

【摘要】：目的： 人工种植技术已经被广泛地应用到牙齿缺失、颌骨缺损等多个方面，成为一种成熟可靠的修复方法。随着种植技术的不断发展，因口腔缺牙接受种植的糖尿病患者越来越多，但其种植的高失败率一直困扰着口腔临床医生，前期研究已证实种植体周围不能形成良好的骨性结合是其失败的主要原因，但其确切的作用机制尚不清楚。 糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。研究已证实，糖尿病会导致人或者动物模型的骨组织钙磷流失，骨代谢异常，以及骨结构和骨质量发生改变。患者颌骨往往因糖尿病影响表现出相关变化，如牙槽骨的丧失及颌骨的骨质改变。颌骨的质量是人工种植体修复成功的基础，糖尿病对颌骨的影响无疑会影响到种植的成功率。 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）具有多向分化潜能以及自我更行能力，这些功能特性使得它成为骨再生修复的重要种子细胞。成骨发生的关键是骨髓间充质细胞向骨形成转变，分化为成骨细胞，但这是一个非常复杂的过程，要受到到多种信号通路信号转导以及基因表达转录调节等组成的复杂信号网络的调控。BMP信号通路是其中最主要的信号通路之一，而该通路中的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一。microRNA（miRNA）是动植物细胞中一类长度为22-25nt具有调控基因功能的小分子非编码RNA，近年来大量文献报道miRNA也参与调控了成骨细胞的成骨分化过程。 目前研究已经证实，高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱，成骨细胞的增殖和矿化能力也减弱，这些都被认为是糖尿病导致骨质下降的原因，但其机制尚不清楚。因此，本实验将研究高糖环境下骨髓间充质干细胞的生物学行为，明确高糖环境对骨髓基质干细胞骨向分化能力的影响及其BMP信号通路在其中发挥的作用，并且从miRNA的角度出发，筛选和验证高糖环境下差异表达的miRNA，研究高糖环境下miRNA和BMP-2在骨髓干细胞成骨分化过程中的调控机制，从而探讨高糖环境影响干细胞成骨能力的分子调节机制，为糖尿病引起的骨代谢异常提供理论依据。 方法： 第一部分:从雄性C57小鼠下颌骨获取原代骨髓间充质干细胞，体外传代培养观察其生长特性。采用流式细胞仪技术对纯化的第四代细胞进行干细胞表面分子标志物的检测。并进行体外成脂以及成骨定向诱导分化实验来检测骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。 第二部分：模拟高糖环境，在四种不同的糖浓度下培养BMSCs，比较在正常糖浓度以及高糖环境中培养的BMSCs的生物学功能，我们用MTT法以及流式细胞仪进行细胞活性、细胞周期以及凋亡的检测，并且通过茜素红染色，ALP活性以及细胞分泌钙、磷量检测不同糖浓度下BMSCs的成骨能力。 第三部分：探讨高糖环境作用下BMP信号通路在BMSCs成骨分化过程中的调控作用,根据前面的实验结果，以25mM的糖浓度作为后续实验的高糖浓度，我们用Real-time RT-PCR方法检测细胞成骨基因RUNX2、 ALP和OCN的表达情况进一步验证高糖对成骨的抑制作用。并在不同糖浓度成骨诱导下用Western Blot检测全细胞蛋白BMP-2的表达水平。之后通过加入外源性BMP-2干预后检测细胞内BMP-2的表达水平以及成骨基因RUNX2、 ALP和OCN的表达水平。 第四部分：用Agilent小鼠miRNA（8*60K）芯片筛选高糖环境培养下差异表达的miRNA，利用实时定量PCR对结果加以验证,选出其中高表达的并且其靶基因可能是BMP-2的miRNA。 第五部分：利用Real-time PCR检测在BMSCs成骨分化过程中miR-467f的表达谱。细胞转染miR-467f双链RNA mimics，利用实时定量PCR检测成骨标志性基因，利用茜素红染色检测细胞体外矿化能力，，验证miR467f对BMSCs成骨分化的影响。利用双荧光素酶报告基因实验验证BMP-2是否为miR-467f可能作用的靶基因。将miR-467f和siBMP-2双链mimics分别转染细胞并诱导其成骨分化，比较两组成骨分化表型，探讨miR-467f抑制BMSCs的成骨分化调控机制。 结果： 1.分离培养的颌骨骨髓间充质干细胞表达间充质细胞表面分子阳性，造血和上皮细胞表面分子阴性，符合干细胞CD分子表型。能成功的进行了成骨、成脂定向诱导分化，符合干细胞的功能特异性。 2.25mM的糖浓度，具有明显的促进细胞增殖的作用。但是糖浓度过高达到35mM时，会抑制增殖殖促进凋亡。成骨诱导后，随着糖浓度的增加，矿化结节的形成量、ALP活性以及钙磷分泌量都大大降低，BMSCs的成骨分化能力降低。 3.25mM的糖浓度下进行成骨诱导，细胞成骨基因RUNX2、 ALP和OCN表达水平降低，BMP-2蛋白的表达水平降低。加入外源性BMP-2上调BMP信号通路后细胞内BMP-2蛋白的表达水平以及成骨基因RUNX2、 ALP和OCN的表达水平都有了显著提高，可见干细胞的成骨能力增强。 4.通过microRNA芯片筛选以及实时定量PCR验证，在高糖环境培养下共有16个下调，11个上调的差异表达miRNA。在上调的miRNA中， miR-467f、miR-2183、miR-3472和miR-345-5p可能与成骨有关且其靶基因可能是BMP-2。 5.在诱导BMSCs成骨分化的过程中，用实时定量PCR检测前面实验中选择的四个miRAN，结果显示miR-467f在成骨过程中持续表达，并且随时间逐渐降低。细胞分别转染miR-467f双链mimics后培养后成骨诱导， RUNX2、ALP和OCN的mRNA表达降低,体外矿化能力下降。BMP-2是miR-467f的作用的靶基因之一。过表达miR-467f可以显著抑制BMP-2基因和蛋白的表达以及RUNX2、ALP和OCN的mRNA表达，该抑制作用和siBMP-2双链mimics对成骨分化的抑制作用相似。 结论： 1.高糖环境影响了小鼠颌骨骨髓基质干细胞的生物学特性，导致其增殖能力增强而成骨分化能力减弱。 2.在高糖环境培养下，存在差异表达的miRNA，其中高表达的miR-467f在BMSCs成骨分化过程中表达降低，而且过表达miR-467f可以减弱干细胞的成骨分化能力。 3. miR-467f抑制小鼠颌骨BMSCs成骨分化是通过调控其特异的靶基因BMP-2发挥作用。 4.高糖环境下miR-467f上调，引起BMP-2表达抑制，可能是高糖抑制BMSCs成骨能力减弱的原因之一。
【图文】：

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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.1;R782.1

【参考文献】

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1 吴璇;刘洪臣;马卫东;鄂玲玲;王东胜;;糖尿病大鼠下颌骨成骨细胞体外特性的研究[J];中华老年口腔医学杂志;2008年02期

2 蒋泽生;高毅;慕宁;;共培养诱导人骨髓多能成体祖细胞分化为肝细胞样细胞[J];中华医学杂志;2007年06期

本文编号：2652152