牙龈卟啉单胞菌脂多糖对血管内皮细胞功能影响的实验研究

发布时间：2020-05-12 22:06

【摘要】： 目的：观察三种不同fimA基因型P.gingivalis-LPS对HUVEC产生致炎细胞因子、趋化因子以及黏附分子的影响,初步探讨P.gingivalis感染在AS发生和发展的可能作用以及作为牙周炎与AS相关的物质基础的可能。 方法：厌氧培养ⅠfimA型(ATCC 33277)、ⅡfimA型(WCSP115)、ⅣfimA型(W83)P.gingivalis,采用热酚-水法提取P.gingivalis-LPS,应用SDS-PAGE+银染、红外线光谱分析、鲎试验对提取的脂多糖予以鉴定；体外培养HUVEC,待HUVEC单层融合后,分别加入不同终浓度的P.gingivalis-LPS,共同培养2h、6h、24h,应用ELISA法测定培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8和MCP-1的分泌量；提取HUVEC总RNA, RT-PCR法检测IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平,FCM技术检测HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1蛋白表达量。 结果：(1)本实验研究条件下所提取的P.gingivalis细菌物质经红外光谱分析和SDS-PAGE电泳分析,表明其结构与Ecoli-LPS相似,系P.gingivalis-LPS,鲎试验表明所提取的P.gingivalis-LPS具有较高的生物学活性(≥15ng/ml),可用于后续的实验。 (2)3型P.gingivalis-LPS作用于HUVEC后,细胞表达IL-1β蛋白水平及mRNA水平升高,在较高浓度(5、10μg/ml)时,Ⅱ型fimA P.gingivalis-LPS刺激HUVEC IL-1β蛋白水平及mRNA的表达强于Ⅰ型fimA P.gingivalis-LPS。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC IL-6水平的升高发生在转录mRNA水平和转录后蛋白水平,且存在着浓度依赖效应；不同fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用存在着差异。在蛋白水平上,Ⅱ型和Ⅳ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激作用强于Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS,但上调作用出现较晚。在mRNA水平上,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表达IL-6 mRNA的作用较强。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC TNF-α蛋白水平及mRNA的表达量上调,且存在着浓度依赖效应,蛋白水平在24h时表达量达到高峰。在一些浓度下,Ⅱ型fimAP.gingivalis-LPS刺激HUVEC TNF-α蛋白水平比Ⅳ型fimA P.gingivalis-LPS的作用强。在mRNA水平上,高浓度(5、10μg/ml)时,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS具有较强的刺激HUVEC表达TNF-αmRNA的作用。 提示3型P.gingivalis-LPS对HUVEC表达IL-1β、IL-6和TNF-α的调节发生在转录和转录后两个水平,从而导致血管内皮细胞功能紊乱,可能在AS的进程中起到关键的作用,且fimA基因型的差异可能导致Rgingivalis-LPS在调控HUVEC产生致炎细胞因子的能力存在差异。 (3)本实验研究条件下,应用3型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC后细胞表达IL-8蛋白水平和mRNA的水平升高,且存在着浓度依赖效应。mRNA水平6h时达到高峰,蛋白水平24h时分泌量达到高峰。3型P.gingivalis-LPS间刺激HUVEC表达IL-8蛋白水平差异无统计学意义(p0.05)。6h时,5μg/ml浓度Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS较强刺激HUVEC表达IL-8mRNA的作用(p0.05)。 在3型P.gingivalis-LPS刺激下,HUVEC MCP-1的升高发生在转录mRNA水平和转录后蛋白水平,且存在着浓度依赖效应,mRNA水平在6h时达到高峰,24h时恢复到正常水平；蛋白水平在24h时达到高峰。Ⅰ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC MCP-1的蛋白表达强于Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS。 提示P.gingivalis-LPS诱导HUVEC产生趋化因子的作用可能在AS进程中发挥作用。fimA基因型的差异可能导致P.gingivalis-LPS诱导HUVEC表达MCP.1的能力存在着差异。 (4)本实验研究条件下,P.gingivalis-LPS刺激HUVEC后表达VCAM-1 mRNA与阴性对照组比较,差异无统计学意义(p0.05)；在6h时,较高浓度的(5、10μg/ml)Ⅰ型和Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS刺激HUVEC表达ICAM-1 mRNA表达增加,Ⅱ型fimA基因型P.gingivalis-LPS这种上调作用强于Ⅰ型和Ⅳ型fimA P.gingivalis-LPS;但在蛋白水平上,本实验条件下未能检测到VCAM-1和ICAM-1蛋白水平的升高。 提示较高浓度下,P.gingivalis-LPS可刺激HUVEC表达ICAM-1mRNA的水平上调,P.gingivalis-LPS对HUVEC产生VCAM-1mRNA的作用不明显。 结论：3型P.gingivalis-LPS均能刺激HUVEC表达致炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,趋化因子IL-8和MCP-1,而且使黏附分子ICAM-1mRNA转录水平升高。不同fimA基因型P.gingivalis-LPS对HUVEC功能的影响存在着差异。提示P.gingivalis感染可引起内皮细胞活化和功能紊乱,从而引发内皮细胞的炎症反应,可能在AS的发生和发展过程中发挥关键作用。
【图文】：

3.4赏试验结果:表1一1不同刀邢A基因型尸g功givalis一LPS及E.coll一LPS邀试验结果分组(Lps浓度n创ml)100502520151052I型卢川月p罗n罗valis-LPs++十++一一一一n型刀脚月尸gin乡va沁一LPS+++++一一一一W型万用月p梦呼valis一LPs+++++一一一一E.coli一LPS+++++一一一一阴性对照为等量的无热源性水，结果均为阴性讨论LPS是革兰阴性厌氧菌细胞壁的主要成分，是重要的毒力因子。LPS被认为pgingivall’s众多致病因子中最重要的毒力因子之一[23l。研究表明pgingivalis一LP

10协ISYBR⑧尸爬m抚ExTa护M(内含兀话故尺aExTa叮⑧HS，dNTpMixture，M扩+，SYoreenl等)、l林l一o娜oFL上游引物、l川10卿01几下游引物、2林1cDNA模板、ddHZO。反应条件为95℃预变性305，，40个循环(95℃变性5s、退火温度见相应的退火温度305、延伸75℃305)。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反延伸期。40个循环的扩增结束后，系统将采集每一循环反应时的各反应管的荧度增长指数进行分析并绘制每一反应管的扩增动力曲线。根据扩增动力曲线确定样本品管中荧光强度增加到某一特定闽值是的扩增循环数(CT值)，根据CT值准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样本的待测基因的标准曲线。(9)作用后HUvEC中IL一lp、IL一6、TNF一a目的基因相对拷贝数的测定:将逆转录得到的样本的cDNA取2川，加入上述反应体系，相同的反应条件行PCR扩增。收集数据，绘制动力学曲线，测定各样品的CT值与标准线进行比与内参基因的CT值加以校正。下下I一
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R781.4

【引证文献】

相关硕士学位论文 前1条

1 崔平平;牙龈卟啉单胞菌上清液对人脐静脉内皮细胞分泌炎性因子的影响[D];昆明医学院;2011年

本文编号：2660908