致龋性变形链球菌蛋白的初级晶体学研究

发布时间：2020-05-13 15:16

【摘要】：目的：龋病是口腔的常见病多发病,并已经成为严重危害人类健康及生活质量的疾病。目前,我国的龋病处于高发状态,迫切需要寻求有效的防龋方法来提高口腔健康防治水平。变形链球菌是人类龋病的主要致病菌,通过对变形链球菌进行结构基因组学方面的研究,更好地理解该菌基因的复杂性和特异性,其如何摄取营养、抵抗宿主防御以适应口腔环境,为新的防治龋病措施的发现和新药物的开发奠定基础。 方法：蛋白质晶体学是结构基因组学的主要研究手段,可用于解析蛋白质三维结构及基于结构的药物设计方面的研究。本实验利用北京大学结构生物学实验室高通量结构基因组学实验平台,通过靶基因筛选、高通量自动化基因克隆和表达、高通量蛋白纯化、晶体筛选、晶体衍射数据收集和晶体结构解析的一整套实验流程进行致龋性变形链球菌蛋白的结构基因组学研究。 结果：本论文的主要工作是对变形链球菌基因组中的两个基因：SMU.2055、SMU.1254进行了蛋白纯化和晶体筛选工作。目的基因被克隆并连入pET28a载体中,SMU.2055、SMU.1254在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中表达、可溶性良好并获得了可溶性较高的蛋白。用金属镍螯合层析和凝胶排阻层析对蛋白进行纯化得到较为均一的目的蛋白,再以坐滴蒸汽扩散法初筛得到目的蛋白的晶体,并通过进一步的优化得到适合上机衍射和数据收集的晶体。其中,SMU.2055的蛋白晶体和其硒代甲硫氨酸蛋白晶体的衍射数据已经被收集,蛋白结构已解析(PDB：3LD2)。SMU.1254的蛋白晶体及其泡重原子晶体衍生物的衍射数据已经被收集,蛋白结构还在解析之中。 结论：致龋性变形链球菌SMU.2055、SMU.1254蛋白的结构基因组学及蛋白质晶体学的研究,原子水平上深入了解变形链球菌中蛋白的结构和功能,为更好的研究变形链球菌蛋白在生物体内代谢及龋病发生、发展进程中的生物学功能作用奠定了基础。
【图文】：

sMu.707(自溶素)、sMU.574(LrgB家族蛋白)，具有与细胞分裂及细胞壁合成相关的功能。变形链球菌通过糖酵解、脂肪酸生物合成、非氧化性磷酸戊糖途径代谢过程由宿主摄取营养物质(见图1)，其中 SMU.1534一1541还参与淀粉酶和支链淀粉酶的降解过程。变形链球菌中的粘附素、胞外酶、蛋白酶、细胞因子等毒力因子参与抵抗宿主防御以及与其他细菌竞争〔10]。s.二taI7s全基因组序列的测定使得人们能更好地理解该菌基因的复杂性和特异性，其如何摄取营养、抵抗宿主防御以适应口腔环境，，这些发现为新的防治龋病措施的发现及新药物的研发奠定了基础。

图4Superdex75洗脱峰位置与蛋白分子量对应图目前对于pET系统表达的带有HIS标签的融合蛋白已有一套比较成熟的蛋白纯化流程。实验采用GE公司生产的快速蛋白液相色谱纯化系统，依次经过金属鳌合层析和凝胶排阻层析两步后可以基本得到培养蛋白质晶体所需的电泳纯蛋白。九、蛋白质结晶及结晶条件的筛选和优化l、蛋白结晶是一个液相与固相转换的过程，即液相中随机分布的分子转变成有规则排列的固相。当蛋白质溶液达到过饱和时，溶液中就会形成晶核，随后蛋白分子不断结合到晶核上形成晶体。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R780.2

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本文编号：2662149